Выпуск самолетов начался на Кубани в марте 1941 г. Фюзеляжи поставлял находившийся здесь же, в Ростове, завод имени Урицкого, шасси — завод № 457 из Запорожья. После начала Великой Отечественной войны завод № 458 эвакуировали в Баку, где сборка УТИ-4 возобновилась. К этому времени завод собрал 310 УТИ-4. До конца 1941 г. были выпущены еще 46 двухместных учебно-тренировочных истребителя УТИ-4Б.

Для использования в качестве боевой машины конструкция учебно-тренировочного УТИ-4 была пересмотрена, в частности под фюзеляжем смонтировали два пулемета БС, а под плоскостями крыла по три направляющие для РС-82 или пилоны, позволявшие подвешивать авиабомбы массой до 50 кг. В кабине летчика устанавливался прицел ПБП-1, позволявший вести прицельное бомбометание и огонь по воздушным целям. Боевой вариант проходил испытания на аэродроме 480-го авиаполка в Касли и на аэродроме 26-го авиаполка, который дислоцировался в 60 км от Баку.

С точки зрения наступательной мощи «военизированный» вариант УТИ-4 превосходил все другие модели И-16. В данный вариант было можно конверсировать все ранее построенные УТИ-4. Испытания самолета завершились в январе 1942 г., но данные о серийном выпуске И-16 «тип 15В» отсутствуют. Всего же завод № 458 изготовил 83 самолета (данные — спорные). В любом случае они стали самыми последними сошедшими с конвейера истребителями И-16.

В 1941 г. ВВС РККА получили 150 дополнительных истребителей И-16 из Китая, самолеты были собраны на заводе в Урумчи. Завод в Урумчи был построен с помощью советских специалистов специально для сборки И-16. К 1941 г. поставки И-16 для китайских ВВС по воздуху прекратились. Самолеты разбирались, перевозились до Урумчи автотранспортом и собирались вновь. Сборочный завод стал известен как завод № 600. Для 1941 г. это было в высшей мере современное предприятие. Завод имел собственную электростанцию и автономную систему водоснабжения. В апреле на заводе находилось 143 И-16, истребители хранились в Урумчи уже несколько месяцев, поэтому было принято решение вернуть их в СССР. Самолеты собирали, облетывали и по воздуху перегоняли в Алма-Ату. К сентябрю в Советский Союз из Китая вернулось 111 истребителей И-16; один самолет разбился в горах в ходе перелета из Китая. До конца года в Алма-Ату прибыли еще 30 истребителей и две спарки. В 1941-42 г.г. завод № 600 продолжал выпускать запасные части к И-16, однако не изготовил и не собрал ни одного самолета.

В начале 40-х годов предпринималось несколько попыток продлить век устаревшего «ишачка». Так в 1942 г. в Иркутске на заводе № 163 изучалось новые деревянные крыло и хвостовое оперение. В 1943 г. руководство завода обратилось в наркомат с предложением восстановить выпуск истребителей И-16, но с новыми крыльями и хвостовым оперением. Предложение иркутян не вызвало энтузиазма в наркомате авиационной промышленности.

Самолет И-16 стал первым в мире массовым истребителем-монопланом с убирающимся шасси. С 1934 по 1942 г.г. было построено 10 292 И-16 всех типов, включая двухместные варианты:

Выпуск истребителей И-16 в 1938–1942 годах по типам:

* с учетом выпуска И-16 тип 18

** с учетом выпуска И-16 тип 27

К лету 1941 г. Германия оккупировала большинство стран Европы. Теперь нацистская военная машина поворачивала на Восток. Вблизи границы с Советским Союзом концентрировались войска, перебрасываемые с Запада. Начиная с мая месяца участили полеты самолетов-разведчиков люфтваффе над территорией СССР, полеты стали едва ли не ежедневными. Советская пресса не уставала отрицать вероятность агрессии со стороны Германии, однако не оставалось сомнений — война не за горами. Группировка РККА в приграничных районах также усиливалась.

На 22 июня 1941 г. в составе ВВС РККА западных военных округов насчитывалось 4226 истребителей, в том числе 1635 И-16 различных типов. По данным Архива министерства обороны СССР на долю И-16 приходилось 26 % от общей численности истребительной авиации.

Количество истребителей И-16 в ВВС западных военных округов:

Ленинградский военный округ 396

Прибалтийский военный округ 142

Западный особый военный округ 361

Киевский особый военный округ 455

Истребители И-16 состояли на вооружении 57 авиаполков, часть из них имела смешанный состав — помимо И-16 на вооружении находились самолеты других типов. Кроме того, «ишачки» мелись в учебных подразделениях, резервных авиаполках, на ремонте. Помимо ВВС РККА истребители состояли на вооружении авиации военно-морского флота; в составе ВВС Северного, Балтийского и Черноморского флотов насчитывалось 778 истребителей, в том числе 344 И-16. На вооружении ВВС Тихоокеанского флота находилось 155 И-16, еще ПО истребителей данного типа имелось в учебных частях авиации ВМФ. На вооружении ВВС РККА и ВМФ имелось также значительное количество самолетов УТИ-4.

Фактически, в первой половине 1941 г. И-16 оставался самым массовым советским истребителем. Самолет, в отличие от новых МиГ-3, Як-1 и ЛаГГ-3, был хорошо освоен летчиками и техниками. Именно И-16 стал основным защитником советского неба от самолетов люфтваффе.

На рассвете 22 июня 1941 г. германская авиация обрушилась на приграничные аэродромы, военные городки, военно-морские базы вдоль всей линии границы. Налетам подверглись 66 аэродромов ВВС. Жертвами внезапного удара стало не менее 900 самолетов, а к вечеру потери советской авиации возросли до 1200 крылатых машин.