Результаты своих исследований Спалланцани немедленно разослал некоторым европейским коллегам. Он просил повторить его эксперименты и сообщить ему о результатах. Большинство полученных ответов подтвердило его опыты, но в одном из них содержались новые, еще более удивительные сведения. Швейцарский энтомолог, орнитолог и ботаник Шарль Жюрин в своих экспериментах с летучими мышами пошел дальше Спалланцани и в феврале 1794 года сделал важное открытие. Он установил, что если уши животных плотно закупорить воском или другим материалом, то они становятся беспомощными и наталкиваются на любые преграды. На основании этого Жюрин пришел к заключению, что, по-видимому, органы слуха летучих мышей принимают на себя функцию зрения, позволяя животным избегать препятствия.

Узнав об опытах Жюрина, Спалланцани вначале отнесся к ним скептически, но как только получил новую партию летучих мышей, сам повторил опыты швейцарского ученого и убедился в его правоте. Спалланцани был дотошным исследователем. Чтобы избежать механического воздействия ушных пробок на ориентацию летучих мышей, он выточил маленькие латунные трубочки и точно подогнал их по диаметру слухового прохода летучей мыши. Стоило заткнуть внешний конец такой трубочки, и летучая мышь оказывалась полностью дезориентированной; если же концы трубочек оставались открытыми, животные, даже ослепленные, летали свободно, легко избегая преграды. Незадолго до смерти, в 1799 году, Спалланцани сделал основной вывод: летучие мыши могут прекрасно обходиться без зрения, но всякое серьезное повреждение слуха для них равносильно гибели. Тем не менее ни Спалланцани, ни Жюрин не смогли дать достоверного объяснения полученным фактам. И не удивительно, так как в их время полет летучих мышей считался совершенно беззвучным. Поэтому выводы этих ученых о преобладающей роли слуха в ориентации летучих мышей их коллегам показались абсурдными, не нашли сторонников, были высмеяны и впоследствии совершенно забыты.

Забвению гипотез Спалланцани и Жюрина немало способствовала теория, выдвинутая в 1800 году блестящим французским зоологом Жоржем Кювье. Он с легкостью отбросил выводы своих предшественников, сославшись на то, что методика их опытов была крайне жестока. Кювье считал, что затыкание ушей само по себе могло оказывать гораздо большее влияние на животных, чем просто ограничение их слухового восприятия. В то время он выдвинул свою так называемую тактильную теорию, из которой следовало, что способность летучих мышей ориентироваться в темноте основана на хорошо развитом у них чувстве осязания. Благодаря авторитету Кювье тактильная теория была принята большинством естествоиспытателей без всяких экспериментальных доказательств и просуществовала в науке более ста лет.

Впервые предположение о наличии звуковой локации у летучих мышей высказал в 1912 году X. Максим — изобретатель скорострельного станкового пулемета. К мысли о звуковой локации Максима привел трагический случай гибели парохода «Титаник», столкнувшегося с айсбергом. Максим предложил для безопасности судоходства локационное предупреждающее устройство, которое сигнализировало бы о приближении к айсбергу. Обосновывая принцип действия своего сигнального аппарата, Максим высказал мысль, что и летучие мыши, возможно, пользуются при полете в темноте звуковой локацией. Это была совершенно новая, прогрессивная постановка вопроса. Однако Максим ошибочно считал, что при полете летучие мыши используют отражения низкочастотных звуков, лежащих ниже слухового порога человека и создаваемых взмахами крыльев.

С другого конца к открытию эхолокации у летучих мышей пришел английский нейрофизиолог X. Хартридж. В 1920 году Хартридж, работая ночью в своем кабинете в Кембридже, заметил, что в открытое окно влетело несколько летучих мышей, которые преследовали насекомых. Закрыв окно, он стал наблюдать за животными, любуясь их быстротой и маневренностью. Его удивило, что они продолжали летать из комнаты в комнату даже тогда, когда свет был выключен, а дверь частично притворена. Будучи экспериментатором, он и тут остался верен себе. Делая щель в двери то шире, то уже, Хартридж установил, что летучие мыши точно определяли свои возможности и ни разу не пытались пролететь в слишком узкую для них щель. Животные совершенно явно располагали средствами, позволяющими им определить, достаточно ли широка щель, совсем не видя при этом двери и не прикасаясь к ней.

Хартридж в то время работал над проблемой зрения, и в его лаборатории была светонепроницаемая камера, в которой он проводил эксперименты. Поэтому ему нетрудно было продолжить исследования и на летучих мышах в темноте. Он снова подтвердил, что зрение летучих мышей не играет роли в преодолении препятствий. Следуя по пути исключения, он в конце концов предположил, что парадокс летучих мышей «видеть ушами» может быть объяснен механизмом эхолокации с использованием звуков высокой частоты, лежащих выше порога слышимости человека и поэтому не воспринимаемых им. Хартридж выдвинул эту гипотезу как возможное объяснение данного явления, но, будучи занят другими исследованиями, не уделил времени ее обоснованию.

Полностью раскрыть тайну летучих мышей помогло появление новой электронной аппаратуры. В одной из лабораторий физического факультета Гарвардского университета в США Г. Пирс начал проводить исследования по изучению свойств ультразвуков. Под его руководством был создан прибор — звуковой детектор, позволяющий улавливать звуки широкого диапазона частот. Именно этот прибор зарегистрировал неслышимые человеком звуки летучих мышей, когда в 1936 году студент-биолог упомянутого выше университета Дональд Гриффин принес в лабораторию Пирса полную клетку летучих мышей. Позднее, в 1961 году, вспоминая об этом, Гриффин писал, что когда он поднес летучих мышей к аппарату Пирса, сразу же обнаружилось, что они издают множество звуков, но почти все эти звуки попадают в диапазон частот, лежащих выше порога слышимости человека.

Пирс и Гриффин провели частотный анализ звуков, издаваемых летучими мышами в полете, и установили, что диапазон их составляет 30–70 килогерц, а область наибольшей интенсивности — 45–50 килогерц. Далее они обнаружили, что от животных исходит звук не непрерывно, а виде дискретных импульсов, длительность каждого из которых всего 1–5 миллисекунд.

Уже эти первые сведения блестяще подтвердили гипотезу Хартриджа о существовании неслышимых звуков, исходящих от летучих мышей при полете в темноте, и позволили по-новому взглянуть на результаты «абсурдных» опытов Спалланцани и Жюрина. Однако теперь требовалось в условиях точного эксперимента доказать, что летучие мыши действительно используют ультразвук в целях ориентировки в пространстве, и что они способны воспринимать эхо этих звуков, возникшее в результате отражения их от встречаемых на пути предметов.