Длительное время не удавалось обнаружить относящиеся к той же эпохе микроокаменелости, которые можно было бы с достаточной степенью уверенности отнести к хемотрофным бактериям, поныне преобладающим среди анаэробов (микроорганизмов, существующих в бескислородной среде). Эволюционно они предшествовали цианобактериям и, следовательно, не могли не быть их современниками. Наконец, в 2000-ом году было сообщено, что в Австралии в осадочных породах, формировавшихся более 3.2 млрд лет тому назад, обнаружены отпечатки нитеобразных микроорганизмов. Породы оказались богаты соединениями серы, что свидетельствовало о их формировании на океаническом дне вблизи выходов лавы и горячих серных источников. На этом основании окаменелые бактерии были отнесены к анаэробным хемотрофам (Rasmussen, 2000; Shen, 2001). Были получены и другие свидетельства присутствия более 3 млрд лет тому назад восстанавливающих CO 2до метана (метаногенных) (Ueno et al., 2006) и восстанавливающих окислы серы анаэробных микроорганизмов (Ohmoto et al., 1993). Таким образом, микроорганизмы, отличные от цианобактерий, также могли претендовать на роль последнего общего предшественника.

Проведенное выше обсуждение показывает, что ствол и ранние ветви дерева жизни могли формировать анаэробные хемотрофы, использующие наиболее примитивные пути накапливания энергии за счет преобразования неорганических соединений: восстановления двуокиси углерода и сульфата или окисления сероводорода. Фотосинтезирующие бактерии, использующие более сложные схемы метаболизма, возникли позже. Причем, по мнению ряда авторов, это были не цианобактерии, использующие в качестве восстановителя при фотосинтезе воду и освобождающие кислород, а фотосинтезирующие бактерии, которые в условиях восстановительной атмосферы могли использовать в качестве восстановителя свободный водород или сероводород (Des Maralis, 1998; Hoehler, 2005; Olson, 2006). По данным Олсона цианобактерии появились не ранее 2.9 млрд лет тому назад, а по другим данным (Kopp et al., 2005) еще позже. Такой подход позволяет объяснить сохранение весьма теплого климата на Земле в течение первого миллиарда лет развития на ней жизни сильным парниковым эффектом, который мог создаваться благодаря присутствию метана, поступавшего в атмосферу при выходах лавы и в результате жизнедеятельности метаногенных бактерий (Pavlov et al., 2000), а также присутствию двуокиси углерода (Hessler et al., 2004). Накопление и сохранение метана были возможны только при отсутствии в атмосфере молекулярного кислорода. С распространением цианобактерий и поступлением значительного количества кислорода в атмосферу содержание в ней метана было сведено, практически, к нулю. Именно с этим обстоятельством связывают не просто похолодание, но глобальное оледенение, имевшее место около 2.2 млрд лет тому назад (Kopp et al., 2005; Kasting and Ono, 2006). Мы видим, что вопрос о времени появления цианобактерий принципиален для интерпретации геохимических процессов в интервале 3.5–2.5 млрд лет тому назад и для правильного отображения дерева жизни.

Очевидно также, что данные палеонтологии не позволяют надежно датировать появление самых ранних ветвей дерева жизни и, соответственно, обоснованно судить об их очередности (см. Schopf, 1999). Успехи молекулярной биологии позволили разработать целый ряд новых подходов к решению этой проблемы. Базовую идею “молекулярных часов” высказали Цукеркандл и Полинг в 1965 г. (Zuckerkandl and Pauling, 1965). К тому времени уже была расшифрована аминокислотная последовательность ряда белков. Среди этих белков были и белки-гомологи, принадлежавшие разным видам. Оказалось, что чем дальше отстоят виды друг от друга, т. е. чем раньше произошло их разделение, тем больше различий в аминокислотных последовательностях гомологичных белков. После успехов в определении нуклеотидных последовательностей ДНК (секвенировании) появилась практическая возможность реализовать аналогичный подход непосредственно на генах, определяя происшедшие в них мутации (замены азотистых оснований, вставки, делеции, дупликации). Естественно, речь идет о полезных или практически нейтральных мутациях, которые сохраняются в потомстве и, следовательно, накапливаются с момента образования вида (Ohta T., 1987; Schuster P., 1993).

Первый вопрос, который следовало решить, возникают ли мутации в генах линейно во времени. С этой целью сопоставлялись данные о числе мутаций, накопленных у определенных видов, с палеонтологическими данными о возрасте этих видов. Такое исследование смогло охватить почти миллиард лет благодаря большому количеству палеонтологических находок, относящихся к этому периоду. Оно показало, что, по крайней мере, в пределах означенного периода линейность накопления мутаций во времени действительно имела место. Было сделано предположение, что эта закономерность выполнялась вплоть до тех давних времен, когда появились самые ранние из дошедших до нас (современных) видов. Учитывая, что речь шла о громадных промежутках времени, предстояло выбрать в клетке объекты (белки или гены), для которых характерен низкий темп изменчивости. Среди белков предпочтительными объектами являются компоненты мультимолекулярных комплексов, например белки рибосом. Структурное изменение в таком белке из-за несогласованности с другими компонентами дестабилизирует весь комплекс. Подобные мутации исключаются из популяции. По той же логике подходящими объектами при “тестировании” дерева жизни являются рибосомные и транспортные РНК. Параллельно с практическим использованием метода молекулярных часов продолжается его совершенствование (Lee, 1999; Douzery et al., 2003; M"uller and Reisz, 2005; Benton and Donoghue, 2007).

Один из первых значимых результатов “молекулярного” подхода к изучению ранних этапов эволюции был получен Уэзом и Фоксом (Woese and Fox, 1978). Авторы анализировали нуклеотидный состав РНК малой субъединицы рибосомы у ряда прокариотических и эукариотических клеток. Они обнаружили, что по признаку присутствия или, наоборот, отсутствия в этой весьма консервативной РНК тех или иных элементов (определенных петель, палиндромов и др.) прокариоты, представлявшиеся до того единым царством, четко делятся на два царства: истинных бактерий (эубактерий) и архебактерий, ныне именуемых, соответственно, бактериями и архе. Оба эти царства происходят непосредственно от стволовой клеточной линии т. н. последнего общего предшественника (last universal common ancestor — LUCA). В настоящее время клетки последнего общего предшественника не рассматриваются как очень примитивные. Самостоятельно существуя во внешней среде (не паразитируя), они должны были иметь не менее 1000 генов (Ouzounis et al., 2006). Разделение стволовой линии на архе и бактерии произошло около 3.5 млрд лет тому назад. Согласно Уэзу и Фоксу, эукариотические (обладающие ядром) клетки ближе архе, чем бактериям, и являются ветвью архе. Этот результат был, в принципе, подтвержден данными морфологического анализа рибосом (Lake et al., 1986). Были использованы также другие подходы. Некоторые авторы (Iwabe et al., 1989; Baldauf et al., 1996) в качестве “молекулярных часов” использовали - и - субъединицы АТФ-азы, а также факторы элонгации Tu и G. Эти пары полипептидов образовались в результате генных дупликаций еще в “стволовой” линии, т. к. присутствуют у всех организмов. Поэтому мутации, накопленные ими в разных линиях, также позволяли оценить самое раннее разделение видов. И в этом случае оказалось, что архе филогенетически ближе эукариотам, чем бактериям. Исследования, проводившиеся разными группами, и многочисленные, порой весьма острые дискуссии (Penny, 1988; Lake et al., 1990; Doolittle and Brown, 1994; Edgell and Doolittle, 1997; Olsen and Woese, 1997) привели к принятому тогда большинством исследователей варианту дерева жизни, основанному на концепции трех царств, впервые сформулированной Уэзом (Рис. 4Б). Самыми первыми ветвями на этом дереве (из тех, что дотянулись до нашего времени) были бактерии и архе. Согласно этой концепции, эукариоты появились как позднейшее ответвление от архе, приобретшее эволюционным путем ядро, цитоскелет и др. (Woese et al., 1990). Первый вопрос, возникающий при рассмотрении предложенного Уэзом дерева жизни с обозначенным на нем стволом, какая из двух линий (бактерии или архе) была стволовой, т. е. “последним общим предшественником”. Мутация или серия мутаций в одной из клеток этой линии инициировала первое ответвление на дереве жизни. Многие авторы полагали, что стволовой линией были архе, а ответвление сформировали бактерии. Главный аргумент — крайне суровые условия, существовавшие на ранней Земле. Бьющие вблизи вулканов насыщенные сероводородом горячие источники — типичная среда обитания современных архе, так и оставшихся анаэробами (Chyba, 1993; Nisbet and Fowler, 1996). В пользу этой версии говорит анализ способов производства энергии разными типами клеток. Самый простой аппарат у архе, использующих энергию водорода, выделяющегося при анаэробном окислении метана и сероводорода. Для грамотрицательных бактерий характерны более сложные процессы — фотосинтез (цианобактерии) и окислительное фосфорилирование (протеобактерии). В обоих случаях энергия запасается в макроэргах (АТФ, ГТФ, НАДФ и др.). Из двух этих способов производства клетками энергии более ранним следует признать фотосинтез, т. к. процесс окислительного фосфорилирования органических соединений нуждается в свободном кислороде, который стал накапливаться в атмосфере с распространением фотосинтезирующих организмов.

Однако существуют веские аргументы в пользу первенства бактерий, конкретно грамположительных бактерий, которые названы так потому, что эффективно окрашиваются (в отличие от грамотрицательных бактерий) при воздействии на них красителем Грама. Среди этих бактерий сохранились термофильные хемотрофы, использующие те же источники энергии, что и архе. С целью обнаружения очередности бактерий и архе в эволюции Р. Гупта (Gupta, 2001) выявлял определенные структурные изменения в древнейших белках, которые могли присутствовать у последнего общего предшественника (стволовая линия) или появились у самых ранних ответвлений. В весьма консервативном по аминокислотному составу белке теплового шока Hsp70 была обнаружена вставка, присутствующая у всех грамотрицательных бактерий, но которой нет ни у грамположительных бактерий, ни у архе. С другой стороны, у Hsp70, принадлежащем архе, обнаружены вставки, которых нет у обеих групп бактерий. Это означает, что стволовой линией являлись грамположительные бактерии и что архе ответвились от грамположительных бактерий еще до появления грамотрицательных бактерий (Skophammer et al., 2007; Servin et al., 2008). Для того, чтобы принять эту концепцию, не вступая в противоречие со сказанным выше, следует принять, что к моменту образования ветви архе предсуществовавшие бактерии либо еще не обладали способностью к фотосинтезу и, тем более, к окислительному фосфорилированию, либо архе утеряли эти качества, заняв ниши, где в них не было необходимости. Переход пальмы первенства к бактериям отнюдь не означал отказа от концепции высокотемпературного окружения в период формирования стволовой линии. Исследования по реконструкции аминокислотных последовательностей в белках самых ранних бактерий указывают на их высокую термофильность (Di Glulio, 2003). То, что ныне многие виды бактерий существуют при умеренных температурах, является результатом эволюции. Отметим, что обнаружены весьма значительные сообщества архе, являющихся аэробами и обитающих в холодных водах (DeLong, 1998).

Рибосомные РНК бактерий и архе, различаясь по размерам и составу оснований, весьма консервативны в каждом из этих царств. Экстраполяции, выполненные Уэзом с использованием данных о частоте мутирования рибосомных РНК, не оставляют отделившейся от стволовой линии ветви, которую мы обозначим как предархе, достаточно времени на превращение рибосомных РНК-бактерий в соответствующие РНК-архе. Однако в тот ранний период, когда аппарат репликации ДНК только формировался и механизмы репарации (исправления) ошибок репликации, как и других мутаций, были далеко не столь совершенны, как ныне, темп мутирования мог быть существенно выше.

Накопленные к настоящему времени сведения об аминокислотной последовательности белков, участвующих в синтезе нуклеиновых кислот, позволили поставить вопрос о генетической структуре “последнего общего предшественника” — клеток, функционировавших непосредственно перед образованием двух самых ранних сохранившихся поныне ветвей. Было установлено, что ферменты, осуществляющие полуконсервативную репликацию ДНК (ДНК-репликазы), у бактерий и архе не являются родственными. Следовательно, они появились уже после разделения ветвей. Из этих, а также ряда других соображений был сделан вывод о принадлежности последнего общего предшественника миру РНК (Poole and Logan, 2005). С другой стороны, было обнаружено, что многие ферменты, осуществляющие в современных клетках синтез предшественников ДНК (дезоксирибонуклеотидов), а также синтез РНК по ДНК (транскрипцию), уже присутствовали у последнего общего предшественника (Leipe et al., 1999). Поэтому вполне обоснованным представляется мнение, что клетки последнего общего предшественника уже обладали ДНК, однако механизмом их синтеза путем полуконсервативной репликации они еще не располагали. Синтез ДНК мог осуществляться путем комплементарного копирования РНК. Этот механизм, известный как обратная транскрипция, используется ретровирусами для создания в зараженной клетке ДНК-копии их РНК-генома. Возможно, геном последнего общего предшественника был представлен гибридными РНК-ДНК биспиральными молекулами. Нить ДНК в гибридных молекулах служила матрицей для комплементарного синтеза РНК. Помимо выполнения функций, связанных с синтезом белков, эта РНК служила матрицей для образования комплементарной нити ДНК и т. д. Возможно также, что полученная обратной транскрипцией нить ДНК служила матрицей для образования комплементарной нити ДНК, т. е. геном последнего общего предшественника был образован биспиральной ДНК. Ее воспроизведение в отсутствие полуконсервативной репликации могло осуществляться через промежуточный синтез нити РНК, обратную транскрипцию и т. д. В этом случае для превращения в клетку современного типа последнему общему предшественнику, уже обладавшему современным генетическим кодом и механизмом синтеза белков на рибосомах (Harris et al., 2003), еще предстояло разработать механизм полуконсервативной репликации ДНК, когда параллельно копируются обе нити “родительской” биспирали с образованием двух “дочерних” биспиралей. Однако именно перед этим этапом эволюции произошло отделение ветви архе, и указанный механизм вырабатывался в обеих ветвях (бактерий и архе) независимо (Leipe et al., 1999). После того, как эта задача была выполнена, перестал функционировать за ненадобностью механизм обратной транскрипции. Теперь только ДНК отвечала как за синтез РНК, так и за собственное воспроизводство.