В 1871 году Кох демобилизовался. На двадцативосьмилетие жена подарила ему микроскоп, и с тех пор Роберт целые дни проводил у него. Он теряет всякий интерес к частной врачебной практике и начинает проводить исследования и опыты, для чего заводит большое количество мышей.

В 1872 году Кох получил назначение на должность уездного санитарного врача в Вольштейне (ныне Вольштын в Польше). Его врачебные обязанности позволили обнаружить, что в окрестностях Вольштейна среди крупного рогатого скота, а также овец распространено эндемическое заболевание – сибирская язва. Эта опасная болезнь поражала лёгкие, вызывала карбункулы кожи и изменения лимфоузлов. Зная об опытах Луи Пастера над животными, больными сибирской язвой, Кох с помощью микроскопа изучает возбудителя, который, предположительно, вызывает сибирскую язву.

Его исследования впервые доказали бактериальное происхождение заболевания.

В 1876 и 1877 годах публикуются статьи Коха по проблемам сибирской язвы, в чем ему содействовали известные ботаник Фердинанд Кон и патолог Юлий Конгейм. Эти работы приносят ему широкую известность. Также Кох публикует описание своих лабораторных методов, в том числе окраски бактериальной культуры и микрофотографии её строения. Результаты работы Коха были представлены учёным лаборатории Конгейма, в том числе Паулю Эрлиху.

Позже Кох предпринимает попытки найти возбудителя туберкулёза, болезни в то время широко распространённой и являющейся основной причиной смертности. Близость клиники Шарите, заполненной туберкулёзными больными, облегчает ему задачу – он ежедневно, рано утром приходит в больницу, где получает материал для исследований: небольшое количество мокроты или несколько капель крови больных чахоткой.

Однако, несмотря на обилие материала, ему всё же никак не удаётся обнаружить возбудителя болезни. Вскоре Кох понимает, что достичь цели можно только с помощью красителей. К сожалению, обычные красители оказываются слишком слабыми, но спустя несколько месяцев работы ему всё же удается найти необходимые вещества.

Ему удалось обнаружить крохотные, слегка изогнутые палочки – палочки Коха.

24 марта 1882 года, когда объявил о том, что сумел выделить бактерию, вызывающую туберкулёз, Кох достиг величайшего за всю свою жизнь триумфа. В то время это заболевание было одной из главных причин смертности. В своих публикациях Кох выработал принципы «получения доказательств, что тот или иной микроорганизм вызывает определённые заболевания». Эти принципы до сих пор лежат в основе медицинской микробиологии.

Но изучение туберкулеза пршлось прервать – германское правительство отправило ученого в научную экспедицию в Египет и Индию определить причину заболевания холерой.

Работая в Индии, Кох объявил, что он выделил микроб, вызывающий это заболевание – холерный вибрион.

В Индии он занимается изучением чумы.

В 1885 году Кох становится профессором Берлинского университета и директором только что созданного Института гигиены. В то же время он продолжает исследования туберкулеза, сосредоточившись на поисках способов лечения болезни.

В 1890 году Кох объявляет, что такой способ найден. Он выделил стерильную жидкость, содержащую вещества, вырабатываемые туберкулезной палочкой в течение её жизнедеятельности – туберкулин, который вызывал аллергическую реакцию у больных туберкулезом. Однако в практике туберкулин применять для лечения туберкулеза не стали, так как он не обладал никакими особыми терапевтическими свойствами, а даже наоборот, его введение сопровождалось токсическими реакциями и вызывало отравление, что стало причиной его острейшей критики. Протесты против применения туберкулина стихли, после того как обнаружилось, что туберкулиновая проба может использоваться в диагностике туберкулеза, что сыграло большую роль в борьбе с туберкулезом у коров.

В 1906 году Роберт Кох делает открытие о том, что муха цеце является переносчиком возбудителя сонной болезни.

Он был всегда внимательным к своим коллегам, но случались, конечно, и научные расхождения, и споры – в частности, с Луи Пастером и Ильей Мечниковым.

Незнакомым людям он казался малообщительным, подозрительным нелюдимым человеком. Но друзья и коллеги знали его как доброго и участливого человека. Он живо интересовался внешней стороной жизни.

Несмотря на то, что наука занимала в жизни ученого главное место, он был заядлым шахматистом, а также большим поклонником творчества Гете.

Портрет Роберта Коха будет неполным, если не добавить несколько штрихов из его личной жизни. В 1867 году молодой ученый женился на Эмме Адольфине Фрац, у них родилась дочь. Этот брак продолжался более четверти века, но полного счастья супругам не принес. Оказалось, что общих интересов у них никогда не было.

В 1893 году Берлин был потрясен сенсацией: маститый профессор Кох развелся со своей супругой и женится на молодой актрисе Хедвиге Фрайбург. Наконец-то Роберт вытянул счастливый билет – молодая жена стала жить только интересами ученого, сопровождая его во всех научных экспедициях. В 1910 году Кох с женой поехали отдыхать в Баден-Баден, где 27 мая сердце выдающегося микробиолога остановилось.