Шрифт:
В 2005 году три группы исследователей независимо обнаружили, что бактерии направленно встраивают небольшие фрагменты чужеродной ДНК (например, куски геномов бактериофагов) в свой геном в виде тех самых спейсеров [311–313] . Оказалось, что встраивание происходит в определенном месте бактериального генома, которое получило название «CRISPR-кассета». Но для чего это бактериям? Группа эволюционного биолога Евгения Кунина (одного из самых цитируемых современных ученых и автора книги «Логика случая») заинтересовалась вопросом о функциях спейсеров. Исследователи проанализировали имеющиеся генетические последовательности CRISPR-кассет и в 2006 году предсказали, что мы имеем дело с системой бактериального иммунитета [314] .
311–313
311. Pourcel C. et al.: CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology 2005, 151(Pt 3):653–63.
312. Mojica F.J. et al.: Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol 2005, 60(2):174–82.
313. Bolotin A. et al.: Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology 2005, 151(Pt 8):2551–61.
314
Makarova K.S. et al.: A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol Direct 2006, 1:7.
Как потом выяснилось, группа Кунина была права не только насчет функции CRISPR-кассет, но и насчет механизма работы бактериального иммунитета. Они предположили, что этот механизм похож на РНК-интерференцию эукариот. Напомню, что при РНК-интерференции короткие фрагменты чужеродной РНК используются особыми клеточными белками для поиска длинных чужеродных молекул РНК и их уничтожения. Аналогично CRISPR-система бактерий использует короткие фрагменты «направляющих РНК», синтезированных со спейсеров, для обнаружения полноразмерных молекул ДНК бактериофагов.
Бактерии производят длинные молекулы РНК, содержащие последовательности всех спейсеров. Эти молекулы разрезаются на короткие фрагменты, каждый из которых соответствует ровно одному спейсеру. Полученные направляющие РНК помогают комплексу белков находить любые генетические последовательности, комплементарные спейсеру, например ДНК вирусов. Обнаруженные фрагменты после опознания разрезаются. Подобно антивирусным программам, бактерии регулярно пополняют свою «базу данных» спейсеров, когда сталкиваются с новыми бактериофагами (если переживают эту встречу).
Подтверждение роли CRISPR-системы в бактериальном иммунитете было опубликовано в 2007 году в журнале Science и принадлежит группе ученых из компании Damsco [315] . Исследователи хотели улучшить йогурт, защитив молочнокислые бактерии от бактериофагов, но волей случая внесли вклад в открытие одного из самых важных методов редактирования ДНК живых организмов.
В 2012 году в журнале Science вышла статья ученых из Медицинского института Говарда Хьюза, в которой было показано, что один из белков бактериальной CRISPR-системы (белок Casp) умеет разрезать молекулы ДНК в строго определенных местах [316] . Для этого достаточно предоставить ему специально подобранные направляющие РНК. Год спустя все та же группа исследователей опубликовала статью под названием «РНК-программируемое редактирование генома клеток человека» [317] . Оказалось, что белок Casp может работать и в клетках человека, если вместе с геном белка Casp внедрить в них ген, кодирующий направляющую РНК к какой-нибудь последовательности человеческой ДНК. Параллельно другая группа исследователей генетически модифицировала мышей с помощью Casp [318] . Но самое интересное было дальше.
315
Barrangou R. et al.: CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 2007, 315(5819):1709–12.
316
Jinek M. et al.: A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012, 337(6096):816–21.
317
Jinek M. et al.: RNA-programmed genome editing in human cells. Elife 2013, 2:e00471.
318
Wang H. et al.: One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013, 153(4):910–8.
Рассмотрим организм, у которого на одной из хромосом возникла новая мутация. Каждому потомку организма передается только одна родительская хромосома из пары, поэтому, если скрестить организм с мутацией (на одной хромосоме) и организм без мутации, половина их потомков унаследует генетическое изменение, а половина не унаследует. Если скрестить полученных потомков, несущих мутацию, друг с другом, четверть особей следующего поколения будет иметь мутацию на обеих хромосомах, половина на одной, а четверть окажется вовсе без мутации. Несложно заметить, что это классическое наследование (по Менделю) не очень эффективно в передаче нового «мутантного» варианта потомкам.
В 2015 году в журнале Science вышла статья с описанием «мутагенной цепной реакции». МЦР — это новый метод быстрого редактирования геномов живых организмов на основе белка Casy [319] . Он позволяет не только внести какую-то последовательность ДНК в определенное место генома, но и обойти вышеупомянутые законы наследования и добиться того, чтобы в результате скрещивания генетически модифицированного и обычного организма получались только генетически модифицированные потомки, причем с мутацией сразу на обеих копиях хромосомы. Как это сделать?
319
Gantz V.M., Bier E.: Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science 2015, 348(6233):442–4.
Мы выбираем место, которое хотим редактировать, и ген, который хотим вставить. Создаем плазмиду, содержащую целевой ген, ген белка Casy и ген специально подобранной направляющей РНК, распознающей желаемое место вставки. Все это обрамляется двумя последовательностями ДНК, комплементарными участкам хромосомы предшествующему и следующему за местом разреза (будущим местом вставки). Плазмида с такой конструкцией переносится в клетку. Внутри клетки синтезируется белок Casy, который связывает направляющую РНК и делает двухцепочечный разрез в комплементарном ей участке одной из хромосом. Клетки не любят разрезы в ДНК (а точнее, «оголенные» концы этих молекул) и пытаются их исправить, снова сшить молекулы.
Иногда для исправления разреза подключается особый клеточный механизм починки ДНК, который в поисках информации о том, как выглядела молекула ДНК до разреза, может обратиться ко второй копии хромосомы. Используя эту информацию, механизм, названный гомологичной рекомбинацией, может проверить, не пропало ли что-нибудь в месте разреза, и восстановить недостающие нуклеотиды.
Если клетка использует для починки вторую копию хромосомы или просто сошьет концы вместе, ничего не изменится. Белок Casy снова сделает разрез, и клетке придется чинить ДНК заново.