9 января 1803 года Гумбольдт и Бонплан из Кальяо поплыли на север в порт Гуаякиль (Эквадор). По пути Гумбольдт производил съемки американскою побережья и прилегающих островов. Он производил также исследования холодного морского течения, идущею с юга на север вдоль этого побережья.

Немецкий географ Карл Риттер назвал это течение именем Гумбольдта, так как он первый установил влияние его вод на климат, растительность и животный мир западною побережья Южной Америки.

Из Гуаякиля путешественники направились в мексиканскую гавань Акапулько, куда и прибыли в конце марта. Гумбольдт решил исследовать Мексику, о которой в то время в Европе почти ничего не знали.

В Мексике Гумбольдт предполагал пробыть лишь несколько месяцев. Но богатство и разнообразие природы этой совершенно неизученной страны, изумительные памятники ее древней культуры задержали его здесь на целый год.

Вскоре после высадки в Акапулько Гумбольдт убедился в неточности географических карт Мексики. Он стал производить многочисленные астрономические наблюдения, на основе которых составлял точные карты своих маршрутов.

Поднимаясь на Мексиканское плато, Гумбольдт пересек горный хребет Сьерра-Мадре и остановился в маленьком шахтерском городке Таско, в котором познакомился с величайшим в мире подземным складом богатств. Серебряные рудники Таско давали тогда две трети мировой добычи этого металла. Горное дело здесь велось старинными методами, при взрывных работах применялся порох. Грязные и угрюмые шахтеры ютились в жутких трущобах, а к рабочим-индейцам владельцы и чиновники шахт относились, как к рабочему скоту.

Из Таско Гумбольдт направился в столицу страны — город Мехико, который поразил его роскошью церквей и дворцов. Вице-король Мексики прислал ему приветственное письмо; все архивы, музеи, библиотеки столицы открыли для него свои научные Сокровища. В распоряжение путешественников был отведен целый дом, расположенный в центре города недалеко от Национальной библиотеки. В настоящее время на этом доме можно видеть мемориальную доску, а у здания библиотеки мраморный памятник Гумбольдту. Город Мехико стал штаб-квартирой научной работы Гумбольдта и Бонплана.

В столице Гумбольдт посетил университет, музеи, читал лекции в горнорудной школе о своих геологических исследованиях. В этих лекциях он впервые познакомил слушателей со своими взглядами на линейное распространение вулканов по земной поверхности вдоль трещин. В Андах и в Мексике Гумбольдт нашел убедительные доказательства линейного расположения вулканов.

Гумбольдт изложил также свою систему последовательности напластований горных пород в различных районах земного шара, основанную на различиях их минералогического состава. Эти идеи Гумбольдта подготовили создание новой ветви геологической науки — стратиграфии. В городе Мехико Гумбольдт подготовил к изданию «Геологический атлас Америки».

На основе астрономических наблюдений Гумбольдт составил карту района Мехико и приступил к созданию географической карты всей страны, на которой он хотел поместить также экономические и этнографические данные.

Целыми днями он ходил по окрестностям города Мехико, изучая древние памятники культуры этой страны. Большая часть культурных ценностей коренных обитателей Мексики — ацтеков была уничтожена завоевателями и католическими монахами; все же кое-что сохранилось от этого варварского уничтожения. Его поразили огромные пирамиды, которые сооружали ацтеки до испанских завоеваний. Гумбольдт скупал древние рукописи ацтеков, делал зарисовки древних скульптур и каменных календарей; правители Мексики и монахи запрещали ему производить археологические раскопки.

Для дальнейшего путешествия Гумбольдту дали местного проводника. «Не может быть, чтобы он был большим ученым, — говорил проводник о Гумбольдте, — потому что он спрашивал все время о простых вещах, которые знает всякий ребенок. Каждую минуту он спрашивал о названиях деревень и ручьев, известных каждому, и из-за плохой памяти вынужден был все записывать. Как ребенок, он запихивал себе в карманы разные камушки и собирал цветочки».

Из Мехико Гумбольдт направился к вулкану Хорульо, который возник за одну ночь 29 сентября 1759 года на плодородной равнине в 160 километрах от берега моря и в 180 километрах от ближайшего вулканического очага. Вулканический конус Хорульо, состоящий из пепла и лавы, поднимался над равниной на высоту более 500 метров. Гумбольдт спустился в кратер этого действующего вулкана, имеющий глубину 80 метров; на дне кратера он обнаружил до 20 маленьких отверстий, из которых, шипя, выходил газ. Бонплан исследовал растительность, поселившуюся на склонах вулкана.

Гумбольдт исследовал и другие крупные вулканы Мексики: Попокатепетль (5452 м), Истаксиуатль (5286 м) и Орисаба (5700 м). Подняться на их вершины он не смог, но определил их высоту тригонометрическим путем; он также установил высоту снеговой линии и смену растительных поясов на склонах вулканов. Закончив исследование вулканической области, Гумбольдт вновь вернулся в Мехико, где он упаковал свои коллекции для отправки в Европу.

Свои исследования в Мексике Гумбольдт впоследствии изложил в трехтомном сочинении «Политический очерк королевства Новой Испании». В этом сочинении дано описание истории, экономики и природных особенностей всей территории страны. Для быстрого экономического развития Мексики Гумбольдт предложил прорыть Панамский канал и дал изображение его трассы в своем «Американском атласе».

7 марта 1804 года Гумбольдт и Бонплан покинули Мексику и направились к острову Кубе, где в 1800 году оставили самую ценную часть своих коллекций, а отсюда — в Соединенные Штаты Америки, в город Филадельфию.

Из Филадельфии Гумбольдт написал письмо президенту Соединенных Штатов Джефферсону и вскоре получил от него приглашение прибыть в Вашингтон.

В Вашингтоне Гумбольдт неоднократно встречался с Джефферсоном и другими государственными деятелями. Американские ученые хотели, чтобы он остался работать в Америке. Один из них писал секретарю Американского философского общества: «Мне жаль, что интересный барон захватил к себе в карман всю Южную Америку. Я хочу, чтобы он на некоторое время дал покой своим ногам и опубликовал все свои работы здесь. Сокровища его знаний стоят больше, чем самый богатый золотой рудник».