Термообработку обычно проводят осенью и зимой. Весной из растений вычленяют пазушные почки от 0,3 до 1 мм и высаживают на питательные среды (МС без гормонов, pH 5,7).

Материалы и оборудование. Клубни картофеля, кюветы с песком, флаконы с водой, кюветы с проращенными и прошедшими термотерапию растениями, ламинарбокс, бинокулярный микроскоп МБС-9 или МБС-10, стерильные скальпели, препарировальные иглы, флаконы с 96 % спиртом, хлорамином, спиртовки, пробирки с питательными средами.

Ход работы.

1. Здоровые клубни картофеля тщательно промыть проточной водой.

2. Клубни обработать стерилизующим раствором (спирт, хлорамин), про мыть проавтоклавированной водой.

3. Вырезать глазки с частью паренхимы (1,5 х 1,5 см) и поместить в кюветы для проращивания и термотерапии.

4. Проростки, прошедшие термотерапию, поместить в 6 % раствор хлорамина на 5 минут, промыть стерильной дистиллированной водой.

5. В ламинар-боксе под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить их в пробирки с питательными средами.

6. Весь растительный материал перенести в культуральную комнату.

7. Результаты зарисовать через 2-4-6-8 недель.

Работа 7. ПОЛУЧЕНИЕ ВЕЗВИРУСНОГ0 ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА МЕТОДОМ ХИМИОТЕРАПИИ В СОЧЕТАНИИ С МЕТОДОМ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ.

Объяснение. Для химиотерапии используют специальные вещества-ингибиторы вирусов: ферменты, влияющие на нуклеиновые кислоты (РНК-азы). Непосредственную обработку клубней ферментом можно проводить методом инфильтрации в вакуумной камере в течение 20 минут, что приводит к большому расходу вещества. Поэтому эффективнее добавлять РНК-азы в питательные среды для культивирования апексов.

РНК-аза стимулирует рост и развитие растений из апексов и ингибирует развитие вирусов. В результате применения такой технологии выращивания на 10–35 % повышается приживаемость меристем на питательных средах, на 30–40 % больше образуется растений-регенерантов.

Материалы и оборудование. Пробирки с питательными средами, ламинар-бокс, фильтры Зейтца, стерильная бидистиллированная вода, флаконы с 96 % спиртом, спиртовки, микроскопы МБС-9 или МБС-10, стерильные инструменты (скальпели, препарировальные иглы, пинцеты), раствор РНК-азы (0,01 н), химическая посуда (колбы на 50-100 мл, стаканы на 50-100 мл, мерные цилиндры), проростки картофеля.

Ход работы.

1. Раствор РНК-аЗы профильтровать через фильтр Зейтца, добавить в 100 мл среды Мурасиге-Скуга и разлить в пробирки с застывшей стерильной средой до 0,5 см.

2. Простерилизовать проростки картофеля в 6 % хлорамине 5 минут.

3. Проростки промыть стерильной дистиллированной водой и поместить в стерильные чашки Петри.

4. В условиях ламинар-бокса под микроскопом вычленить апикальные меристемы и поместить на среды без фермента (контроль) и с ферментом (опыт).

5. Пробирки с меристемами перенести в культуральную комнату.

6. Результаты зарисовать через 2-4-6 недель, сделать выводы.

ТЕМА III. ДЕДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ И КАЛЛУСОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ.

Работа 1. ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ ТАБАКА.

Объяснение. Каллусная клетка, в результате деления которою возникает кал лус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки. Для растения in vivo каллус — это группа клеток, возникающая при травмах и защищающая место поранения (раневая паренхима). В ней накапливаются питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа.

Дифференцированные клетки объединяются в растении в ткани и выполняют оп ределенные функции. Клетки различаются не только функционально, но и морфологически.

На питательных средах с большим содержанием ауксинов (2,4 Д) клетки экспланта дедифференцируются и переходят к пролиферации. Особенности дедифференциации клеток экспланта зависят от генетики и эпигенетики экспланта. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Причем, чем меньше структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче получить каллус.

В клетке, готовящейся к делению, стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ДНК, исчезают специфические тканевые белки-антигены, синтезируются новые, специфичные для каллусных клеток. Меняется активность структурных генов и белкового аппарата клеток. Дедифференциация специализированных клеток начинается с обогащения их элементами цитоплазмы: микротрубочками, мембранами ЭПС и комплекса Гольджи, рибосомами, исчезают хлоро- и хромопласты, продукты их деятельности; может образоваться много ядер или увеличиться число хромосом; укрупняются вакуоли.