Некоторые плазмидные векторы содержат промотор, работа которого регулируется температурочувствительным белковым продуктом гена-репрессора. Белок-репрессор активен при определенных температурах и блокирует действие промотора. Повысив температуру до 42 °C, можно "включить" промотор и быстро получить большое количество требуемого белка.

В качестве индуцибельных промоторов используют также Тrр-промотор триптофанового оперона, который регулируется триптофановым голоданием, lас-промотор лактазного оперона, который индуцируется субстратом (лактозой) и другие.

Интенсивность транскрипции определенных структурных генов может зависеть от эффективности ее терминации, в частности, от того, как часто РНК-полимераза прекращает синтез РНК, не дойдя до этих генов. Сравнительно недавно обнаружено, что во многих оперонах E.coli, контролирующих биосинтез аминокислот, между промотором и первым структурным геном имеется терминирующая последовательность. В определенных условиях происходит образование терминирующего сигнала, ослабляющего интенсивность транскрипции.

Это явление получило название аттенуации, а участок ДНК — аттенуатор (ослабитель). Как и репрессия, аттенуация зависит от присутствия в среде соответствующих аминокислот. Например, избыток триптофана в клетках триптофанзависимых мутантов, дефектных по репрессору, только 1 из 10 молекул РНК-полимеразы, начавших транскрипцию, преодолевает аттенуатор и считывает структуру генов. Удаление триптофана втрое повышает эффективность транскрипции генов. В отличие от репрессии, антенуация зависит не от самой аминокислоты, а от триптофанил — тРНК (аминокилоты, присоединенной к соответствующей тРНК).

На эффективность продуктивности рекомбинантной ДНК в существенной степени влияет количество копий этой ДНК в расчете на клетку. Суммарная активность экспрессируемого гена растет с ростом копийности плазмиды. Таким образом, используя многокопийные плазмиды, можно достичь сверхсинтеза нужных белковых продуктов. Обычно используемые плазмидные векторы (pBR 322 и др.) поддерживаются в клетке в количестве 20–50 копий. Сейчас исследователи имеют в своем распоряжении температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до одной-двух тысяч копий на клетку, не нарушая ее жизненно-важных функций. Таким образом, можно достичь сверхпродукции плазмидных генов бактериальными штаммами-сверхпродуцентами.

Регуляция экспрессии у Е. coli происходит также и на уровне трансляции. Последовательность оснований длиной 6–8 нуклеотидов, расположенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУГ, определяет эффективность трансляции.

Эта последовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой. Как правило, он отстоит на 8 нуклеотидов от инициирующего кодона, и его сдвиг в ту или иную сторону может резко снижать эффективность трансляции соответствующей мРНК. Описанный участок называется последовательностью Шайна-Дальгарно, по имени исследователей, впервые его идентифицировавших.

В состав вектора кроме всего прочего должен входить маркерный ген, позволяющий селектировать измененные клетки. Часто в качестве селективных используют широко распространенные в природе гены ферментов, модифицирующих антибиотики и инактивирующие их действие.

Особенности организации генома эукариот

У эукариотических организмов механизм регуляции транскрипции гораздо более сложен. В результате клонирования и секвенирования генов эукариот обнаружены специфические последовательности, принимающие участие в транскрипции и трансляции.

Для эукариотической клетки характерно:

1. Наличие интронов и экзонов в молекуле ДНК.

2. Созревание и-РНК — вырезание интронов и сшивка экзонов.

3. Наличие регуляторных элементов, регулирующих транскрипцию, таких как:

а) промоторы — 3 вида, на каждый из которых садится специфическая полимераза. Pol I реплицирует рибосомные гены, Pol II — структурные гены белков, Pol III — гены, кодирующие небольшие РНК. Промотор Pol I и Pol II находятся перед участком инициации транскрипции, промотор Pol III — в рамках структурного гена.

б) модуляторы — последовательности ДНК, усиливающие уровень транскрипции;

в) усилители — последовательности, усиливающие уровень транскрипции и действующие независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК;

г) терминаторы — специфические последовательности, прекращающие и трансляцию, и транскрипцию.

Эти последовательности по своей первичной структуре и расположению относительно инициирующего кодона отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК-полимераза их не "узнает". Таким образом, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем прокариотических регуляторных элементов. Это обстоятельство необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии.