Неожиданное несчастье в 1649 году прервало учение: один за другим быстро умерли отец Мальпиги, мать и бабушка (мать отца). Как старшему сыну Марчелло пришлось ехать в Кревалькоре устраивать дела своей многочисленной осиротевшей семьи (у него было четыре брата и три сестры). Похлопотав некоторое время, Марчелло оставил дела завешать своему дяде, а сам вернулся в университет. Следующим предметом была метафизика, которую он изучал под руководством иезуитского патера Готтарда Беллони. По совету своего первого учителя Натали Марчелло избрал для специализации медицину, в которой его более всего привлекала анатомия. На медицинском факультете его основными учителями были: по анатомии Бартоломео Массари, а по клинической медицине — Андреа Марирани.

Пройдя обучение в университете, Марчелло в 1653 году защитил диссертацию на степень доктора медицины. Спустя три года ему поручили чтение лекций по медицине в Болонской высшей школе (Archiginnasio), но его враги и завистники, одним из которых был профессор теоретической медицины Монтальбани, до того отравляли ему жизнь своими преследованиями, что он охотно принял предложение герцога Тосканского Фердинанда II занять вновь учрежденную кафедру теоретической медицины в Пизе. В конце 1656 года экстраординарный профессор Мальпиги приступает к чтению лекций.

В доме профессора математики Альфонсо Борелли, с которым сблизился Мальпиги, анатомы производили вскрытия животных. Великий герцог Тосканский Фердинанд и принц Леопольд присутствовали при анатомических вскрытиях и вообще относились к происходящему в кружке с живейшим интересом. В дальнейшем они приглашали ученых во дворец для демонстраций. Благодаря интересу правящих лиц к анатомии и физиологии, в 1657 году возникла Экспериментальная академия, основанная принцем Леопольдом и приобретшая впоследствии большую известность.

В этот период Мальпиги ведет исследования над природой крови, пишет работы о моче, о действии слабительных, о пищеварении. Однако работа его прерывается известием о распре, разгоревшейся между его братом Бартоломео и соседним семейством Сбаралья, владения которого граничили с землями семейства Мальпиги в Кревалькоре. Этой сваре, сделавшейся хронической и принявшей весьма резкие формы, суждено будет часто вторгаться в жизнь ученого. Отчасти по нездоровью, частично из желания быть поближе к своему дому и родне Мальпиги получает разрешение у великого герцога возвратиться в Болонью. Здесь он снова занимает в университете профессорскую кафедру.

Ох уж этот итальянский темперамент. В конце 1659 года на Мальпиги обрушилась очередная неприятность. Его брат Бартоломео и представитель враждебной семьи доктор Томмаза Сбаралья встретились вечером на одной из улиц Болоньи и затеяли драку, в ходе которой Бартоломео смертельно ранил Томмазо ударом стилета. Бартоломео был осужден к смертной казни, но, просидев полтора года в тюрьме, пока не окончилась тяжба между семьями, по ходатайству Мальпиги был помилован. На второй год после своего возвращения в Болонью Мальпиги был глубоко огорчен смертью своего второго учителя Андреа Мариани (1661 г.). В том же году в Мессини освободилась кафедра медицины (после смерти профессора Пиетро Костелли) и мессианский сенат пригласил на эту кафедру Мальпиги. Получив четырехлетний отпуск от руководства Болонского университета, он в октябре 1662 года выехал в Мессину. Здесь, в Мессине, Мальпиги занимался преимущественно анатомией растений.

В 1684 году Мальпиги приобрел в собственность виллу в Кортичелли близ Болоньи. В этом же году его вновь постигло несчастье: в его доме, в Болонье, случился пожар, уничтоживший значительную часть его имущества, микроскопы и большое количество рукописей, содержавших ценные научные материалы. В 1689 году на него обрушилось еде одно несчастье. Пропорционально славе Мальпиги росла и неприязнь к нему Монтальбани. Недоброжелатели Мальпиги, не будучи в состоянии навредить его научной репутации, задумали причинить ему материальный урон. Один из членов семьи Сбаралья и некто Мини, неоднократно нападавший на Мальпиги в полемических статьях, организовали шайку молодых людей, которая напала на виллу в Кортичелли. В результате атаки обстановка внутри дома была разгромлена, научные приборы и материалы сожжены.

Это происшествие окончательно истощило терпение 61-летнего Мальпиги. Он отказался от чтения лекций и уединился в своем доме. В 1691 году Мальпиги принял приглашение римского папы и отправился в Рим, где был назначен личным врачом Иннокентия XII. В Риме он сильно хворал, давала о себе знать подагра. 25 июля 1694 года у него случился апоплексический удар, после которого он оправился и стал работать, готовя свои научные труды к изданию. Вскоре скончалась его жена. Смерть любимого человека причинила ему глубокое страдание, он был безутешен. 29 ноября 1694 года последовал второй апоплексический удар, который через сутки унес жизнь Мальпиги. При его вскрытии обнаружили сильное увеличенное сердце и следы кровоизлияния в мозговые желудочки. Тело согласно завещанию было предано земле в Болонье. В честь Мальпиги в Болонье была выбита медаль, в университете поставлена его статуя и рядом, словно в насмешку, статуя его врага доктора Сбаралья.

Деятельность Мальпиги была разносторонней: он был пионером в области гистологии, эмбриологии, анатомии, ботаники, даже минералогии (написал статью о происхождении металлов). Строго говоря, его скорее можно назвать предтечей, чем основателем этих научных дисциплин. Кроме того, он был также ученым-медиком и практическим врачом, причем врачом-клиницистом, который интересовался болезнями не только с точки зрения врачевания, но и как предметом изучения: он не упускал случая присутствовать при вскрытиях лиц, умерших от тех или иных болезней, и знакомиться с болезнями, выявленными в их органах.