В своих опытах ученый доказал активирующее действие на неоплодотворенные яйца сильной серной кислоты, электризации посредством трения и горячей воды. Следует отметить, что найденные Тихомировым активаторы во многих случаях существенно повышали процент пигментированных яиц в обработанных пробах. Однако пигментация в большинстве случаев была неполноценной и имела отклонения от нормы. Это соответствовало уродливому развитию зародыша внутри яйца и отсутствию вылупившихся гусениц в обработанной грене.

Заключение Тихомирова сводилось к тому, что практическое применение искусственного партеногенеза не представляется возможным. Само явление он объяснял тем, что искусственный раздражитель заменяет собой раздражение, которое вызывает сперматозоид после проникновения в яйцо. Согласно теории Тихомирова, искусственный партеногенез представляет собой проявление раздражимости — внутреннего свойства всего живого.

Мы уже говорили о двойной функции сперматозоида в процессе оплодотворения. Четкое представление об этой функции было и у Тихомирова, поэтому уродливое развитие искусственно активированного яйца без материала сперматозоида не было для него удивительным. Оно, напротив, подчеркивало необходимость материала мужской гаметы для развития яйца и делало работу с искусственными раздражителями бесперспективной.

Если активирующие агенты способствуют увеличению процента развивающихся яиц по сравнению с контролем, чем же тогда вызвана их активация в самом контроле? Скорее всего, в данном случае играют роль какие-либо неизвестные внешние факторы. Эта точка зрения согласуется с мнением Тихомирова о влиянии на способность яиц к партеногенетическому развитию. Она соответствует и мнению других исследователей о влиянии условий среды, сезона выкормки, качества скармливаемого гусеницам листа шелковицы на уровень спонтанного партеногенеза.

Тихомиров выявил методический прием, который определил успех всех последующих исследований, связанных с партеногенезом тутового шелкопряда. С целью последующей обработки он извлек зрелые яйца из яйцевых трубок девственных бабочек. Таким образом ученый решил 2 проблемы. Во-первых, отпала необходимость ждать, пока неосемененные самки отложат необходимое для опытов количество неоплодотворенной грены. Кроме того, пробы синхронизированных яиц можно отбирать подходящей меркой. Во-вторых, ликвидировались внешние факторы, оказывающие воздействие на яйцо при откладке. Появилась возможность контролировать саму процедуру извлечения.

В 1903 г. Тихомиров прекратил опыты по искусственному партеногенезу. К тому времени они уже широко проводились на других животных объектах, в частности на морских беспозвоночных. Открытие искусственного партеногенеза дало исследователям возможность предположить, что может быть найден способ замены живого сперматозоида хорошо известными физико-химическими факторами.

Это помогло бы выяснить причины, вызывающие развитие яйца при условии его естественного взаимодействия со спермием.

Данный вид взаимодействия приводит в первую очередь к активации яйца. Этот процесс более доступен для наблюдения у морских беспозвоночных, чем на яйцах тутового шелкопряда. По этой причине исследования механизмов естественной и искусственной активации яйца были перенесены с тутового шелкопряда на морского ежа, а затем на земноводных и млекопитающих.

Впоследствии сторонниками физико-химического направления проводились опыты по поиску заменителей действия сперматозоида на яйцо. Например, Жак Леб полагал, что причиной деления клеток является несоответствие между запасными веществами цитоплазмы и хроматиновым веществом ядра. Действие сперматозоида заключается в запуске и ускорении синтеза хроматина ядра из веществ цитоплазмы. Положительный катализатор, привносимый спермием в яйцо, не был обнаружен, поэтому ученые предположили возможность наличия отрицательного катализатора в самом яйце. Этот блок устраняется сперматозоидом в процессе оплодотворения. При естественном партеногенезе этот блок отсутствует, а при искусственном нейтрализуется в результате действия подобранного агента.

Леб постепенно усложнил процедуру активации яиц морского ежа и вывел двухступенчатый метод искусственного партеногенеза. Первый этап состоял в выделении оболочки оплодотворения под действием цитологического агента, в качестве которого использовалась валериановая или масляная кислота. После этого начавшееся развитие доводили до нормы путем непродолжительного действия гипертонического раствора морской соли, вызывающего образование дополнительного центриолярного аппарата (астросферы). Это необходимо для нормального деления яйцеклетки. Используя данный метод, Леб получил большое количество партеногенетических личинок и пришел к выводу, что метод воспроизводит действие сперматозоида.

По мнению Леба, сперматозоид вносит в яйцо как литический, так и корректирующий фактор. Однако нередко результаты исследований не соответствовали представлениям ученого. Помимо этого, литические и корректирующие явления внутри яйца не подлежали толкованию в физико-химических понятиях.

Ученые считали, что основой деления клеток является процесс периодического желатинирования и разжижения цитоплазмы. На этом основании исследователь партеногенеза Ив Деляж решил запустить развитие яйца, вызвав данные изменения искусственным путем, и добился положительных результатов при использовании в качестве раздражающих агентов таннина и аммиака. В результате эксперимента практически все яйца начали развиваться, многие достигли стадии личинки, а некоторые и взрослого состояния.