Тем временем в верхах назревал крупный политический конфликт, когда в июне 1604 года своим указом Климент VIII взамен умерших назначил новых кардиналов, настроенных в основном профранцузски. Это вызвало явное раздражение нового посла Испании и обострило трения между новоявленными родственниками — происпански настроенным кланом Фарнезе, с одной стороны, и известным своими симпатиями к Франции родом Альдобрандини — с другой. Начался обмен письмами и нотами между недовольным Мадридом и Римом. Напуганному папе пришлось умерить пыл своего не в меру воинственного племянника Пьетро Альдобрандини, который собирался с преданными ему гвардейцами чуть ли не штурмом брать дворец Фарнезе, где засели его политические противники во главе с бывшим товарищем по тайным оргиям Одоардо Фарнезе, которого негласно поддерживал кардинал-викарий Камилло Боргезе. Напряжение нарастало в высших кругах, а простой люд продолжал жить своей жизнью, не проявляя симпатий ни к одной из враждующих сторон.

Случайно в эту политическую интригу косвенно оказался втянутым и Караваджо. Это случилось воскресным вечером 17 октября. После веселого застолья в одном из трактиров на Кампо Марцио, где Караваджо с друзьями отмечал успех «Богоматери паломников», помолиться перед которой приходили толпы римлян, весёлая компания направилась к площади Навона. В темноте на их пути выросла кучка незнакомцев, не пожелавших посторониться и уступить дорогу. Тогда с криком «Да здравствует Франция!» подвыпивший Лонги запустил в них камнем, и началась потасовка. Появившаяся полиция задержала всю компанию и препроводила в участок. Оказалось, что ввязавшиеся в драку парни были из числа сторонников Фарнезе. Караваджо успел передать увернувшимся от задержания Габриэлли и Милези, чтобы они бежали в соседний дворец Мадама к кардиналу дель Монте и сообщили ему о случившемся. Впервые после четырёхлетней разлуки он решил обратиться за помощью к бывшему патрону и благодетелю. Неизвестно, откликнулся ли тот на просьбу о помощи, но после составления протокола художник был отпущен восвояси, а главному зачинщику драки Лонги пришлось провести несколько дней в Тор ди Нона.

Удачно выпутавшись из неприятной истории и опасаясь новых злоключений, художник спешно приступил к написанию большого полотна «Положение во гроб» (300x203) для Санта-Мария ин Валличелла или Кьеза Нуова (Новой церкви), ставшей лабораторией утверждающегося стиля барокко. Это была та самая церковь, где бездомный оборванец Микеланджело Меризи однажды свалился в голодном обмороке и где он чувствовал себя счастливцем, если удавалось вместе с другими бедолагами получить тарелку горячей похлёбки и кусок хлеба в трапезной братства преподобного Филиппа Нери.

Из густого непроницаемого мрака пещеры вырастает монументальная шестифигурная композиция. Благодаря эффекту обратной перспективы персонажи картины, стоящие на каменной плите, нависшей над пропастью могилы, максимально приближены к зрителю, который невольно становится участником происходящего. Луч слева высвечивает обнажённое тело мёртвого Христа с опрокинутой назад головой и безжизненно свесившейся рукой. Любимый ученик Иоанн удерживает на весу бездыханное тело спереди, а старец Никодим, напрягшись, держит ноги. Над ними возвышаются озарённые мягким светом три Марии — застывшая в безутешном горе постаревшая Дева Мария, чьи распростёртые длани намекают на Распятие, рядом Мария Магдалина с поникшей головой и узнаваемым профилем Лены, а справа Мария Клеопова с воздетыми к небу руками, словно указывающая на предстоящее Христово Воскресение. Эти воздетые вверх руки завершают диагональ композиции, начавшейся с руки Христа, безжизненно повисшей над бездной.

Здесь отчётливо видно стремление автора к монументальной пластичности фигур в духе Микеланджело при написании картины, исполненной трагической патетики. Неслучайно её называют «классическим интермеццо», как дань великому наследию Возрождения. Высказывается предположение, что в образе фарисея Никодима, ученика Христа, приходившего к нему тайно, ночью (Ин. 3:1-2), художник запечатлел Микеланджело. Если это так, то моделью наверняка послужило изображение Микеланджело в образе философа Гераклита на фреске Рафаэля «Афинская школа» или изваяние «Пьета», на котором, по утверждению Вазари, великий мастер изобразил себя в образе старца Никодима. О новаторстве стиля художника говорят интенсивность красок на фоне густых непроницаемых теней и резкие контрасты светотени, усиливающие драматизм сцены. В картине поражают верность натуре и реалистический показ отдельных деталей. Например, натруженность ног старика Никодима с вздувшимися венами или же упирающийся прямо в зрителя угол тяжёлой каменной плиты. Выбранная автором точка зрения «снизу вверх» придаёт особую величественность и монументальность образам. Создаётся даже впечатление, что стоящие перед картиной зрители находятся на дне склепа, из которого пробился отросток тиса, препятствующего гниению, о чём было сказано выше, и им надлежит принять из рук Иоанна и Никодима тело Христа.

Трагическое «Положение во гроб» — это реквием возвышенной скорби по той неосознанной пока живущими на земле людьми великой жертве, которая была принесена Христом ради их спасения. Картина не оставила равнодушными даже противников художника. Бальоне и Беллори сочли её лучшим творением Караваджо. Никому из его современников не под силу было сотворить что-либо подобное. Даже известные картины Рафаэля и Тициана на тот же сюжет уступают творению Караваджо по силе эмоционального воздействия. С картины снимали копии крупнейшие мастера различных эпох — от Рубенса до Сезанна.

Несмотря на шумный успех, спустя некоторое время «Положение во гроб» было отвергнуто церковниками, которых смутили и напугали трагедийность звучания картины и жизненная достоверность персонажей. Её постигла та же участь, что и первый вариант «Святого Матфея» и обе доски для церкви Санта-Мария дель Пополо. К счастью для Караваджо, об этом он так ничего и не узнал, поскольку картину вынесли и упрятали в подвал, когда он уже покинул Рим. Она была извлечена на свет после более чем двухвекового заточения и оказалась в созданной в 1908 году Пинакотеке Ватикана. В 1608 году место отвергнутой картины в Кьеза Нуова занял триптих работы молодого Рубенса.

Когда художник накладывал на холст завершающие мазки, в переулке Сан-Бьяджо появился посыльный с вестью о кончине старого кардинала Маттеи. Отложив все дела, Караваджо поспешил во дворец Навичелла для выражения соболезнования братьям Маттеи. Через два дня состоялось отпевание в Санта-Мария ин Валличелла, куда пришло несметное количество народа проститься с кардиналом Джероламо Маттеи, учеником и последователем преподобного Филиппа Нери, чьи страстные призывы к добру и справедливости запечатлелись в памяти благодарных людей. Слушая скорбные звуки органа, Караваджо вспомнил, почувствовав ком в горле, как старый кардинал молча поддерживал его своим неслышным появлением в мастерской, когда он с остервенением работал над «Призванием апостола Матфея», а по завершении работы так же молча перекрестил его. Вернувшись домой, он долго сидел перед почти завершённой картиной, которая предназначена для церкви, где только что прошло отпевание. А как бы воспринял кардинал Маттеи его новую работу? Затем он подошёл к холсту и, взяв кисть с палитрой, слегка поправил безжизненно свесившуюся к бездне руку Христа, придав ей ещё большую мертвенную бледность.