Шрифт:
Первоначально среда Нельсона была очень сложна. Затем Нельсон значительно упростил ее, но она все еще сложна. A. Bellone и М. Bonelli (1957) в качестве среды для сохранения трепонем применяют разведенную изотоническим раствором натрия хлорида сыворотку человека (2:1), а К. Meinike и К. Lagel (1959) – сыворотку кролика (2:1 или 1:1). Следует отметить, что трепонемы, взвешенные в одном изотоническом растворе натрия хлорида и особенно вместе с сывороткой больного и комплементом в небольшой дозе, выживают, судя по контрольным исследованиям, и без какой-либо среды, однако сроки их выживания значительно короче, подвижность менее активна, и наблюдается значительное количество сомнительных результатов.
Н.М. Овчинников (1961, 1962) предложил для РИБТ простую среду. Готовят 0,2% раствор пищевого желатина на 0,83 % растворе натрия хлорида. Раствор стерилизуют автоклавированием при температуре 110°С в течение 10 мин, после чего добавляют стрептомицина сульфат из расчета 1:10000. Среда для опыта состоит из сыворотки кролика, разведенной 1:2 изотоническим раствором натрия хлорида, желатина и раствора человеческого альбумина. Альбумин готовят на изотоническом растворе натрия хлорида, стерилизуют фильтрацией через бактериальный фильтр (пригоден только сухой альбумин, лиофильно высушенный); каждый раз при употреблении новой серии следует испытать, параллельно со старой, новую серию. Весь запас ингредиентов хранится в обычном рефрижераторе.
На 10 сывороток требуется 1,2 мл 0,2 % раствора желатина, 2,8 мл 5 % раствора альбумина и 1,6 мл взвеси трепонем. Вымывание трепонем обычно производят разведенной кроличьей сывороткой, но можно с самого начала использовать указанную среду сохранения. Особенно следует обращать внимание на возможность у кроликов спонтанного спирохетоза, при котором могут наблюдаться положительные результаты реакции или спонтанная агглютинация трепонем.
При хранении ингредиентов рН среды может меняться. В случае окисления среды к ней следует добавить 1 % стерильный раствор натрия гидрокарбоната до рН 7,2.
Реакция протекает только при условии избытка комплемента, поэтому применяют различные количества комплемента, что в значительной степени зависит от примененной среды. При пользовании одной и той же средой установлено, что чем больше взято комплемента, тем больше находят иммобилизованных трепонем, а чем меньше комплемента, тем больше подвижных трепонем. При употреблении желатиновой среды оптимальное количество комплемента равно 0,15 мл на каждую пробирку. Комплемент применяется свежий, полученный от морской свинки. Консервированный комплемент непригоден.
Техника постановки реакции. Пронумерованные пробирки с сыворотками расставляют в штативе. В журнале нечетными номерами отмечают все смесители, в которые добавлялся активный комплемент (опыт), и четными номерами – куда добавлялся инактивированный комплемент (контроль). Комплемент добавляют не для каждой сыворотки отдельно, а готовят «коктейль», т. е. предварительно соединяют комплемент с антигеном в нужных соотношениях для всех сывороток. Взвесь трепонем в питательной среде из расчета по 0,3 мл на каждую сыворотку делят на 2 части и добавляют в один флакон активный комплемент, а в другой – инактивированный.
В стерильный смеситель для лейкоцитов набирают сыворотку до метки 1. Конец смесителя стерильной ваткой вытирают от сыворотки, оставшейся на стенках. Это необходимо, так как при попадании положительной сыворотки в антиген в последующих сыворотках могут быть получены неверные результаты. Во избежание загрязнения при больших постановках разливают антиген параллельно в два флакона. После этого набирают взвесь трепонем с активным комплементом до метки 2. В другой смеситель набирают взвесь трепонем с инактивированным комплементом. Оба конца каждого смесителя закрывают резиновым кольцом, как для транспортировки крови, взятой для клинического исследования, и встряхивают для смешивания. (При отсутствии таких колец их можно сделать, разрезав полую резиновую трубку диаметром до 1 см вдоль и соединив концы). Кольца до опыта и каждый раз после его проведения следует кипятить. Во избежание возможного влияния некоторых сортов резины места ее соприкосновения со смесителем следует смазывать стерильным вазелиновым маслом. Можно не закрывать концы смесителя резиновыми кольцами, а заливать их парафином с температурой плавления выше 50°С (парафин с более низкой температурой плавления непригоден, так как при помещении смесителей в термостат парафин может стечь и герметичность системы будет нарушена), однако это менее удобно. Благодаря тому, что оба конца смесителя закрыты, прекращается доступ воздуха, взвесь трепонем находится в относительно анаэробных условиях.
Для контроля набирают в те же смесители все взвеси с активным и инактивированным комплементом, а также одну взвесь без комплемента. Ставят также реакцию иммобилизации с сыворотками, заведомо отрицательными и заведомо положительными, оставшимися от прошлой постановки.
Заполненные и закрытые смесители помещают в специальный штатив или коробку с вырезами. На каждый смеситель надевают нумерованные кольца из картона. Смесители помещают в термостат при температуре 35 °С на 18-20 ч. Для регистрации опыта через 18 ч смесители вынимают из термостата попарно – опыт и контроль.
Подсчет подвижных и неподвижных трепонем. По количеству смесителей в штативе расставляют и нумеруют маленькие пробирки (12х60 мм). Содержимое смесителя выливают в соответствующую нумерованную пробирку, перемешивают тем же смесителем с надетой на него пипеткой и наносят каплю взвеси с активным комплементом на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону – с инактивированным комплементом той же сыворотки; посредине стекла ставят номер сыворотки. Капли накрывают покровными стеклами 20х20 мм. Капли должны быть небольшими, иначе трепонемы «плывут» с током жидкости, и тогда суждение об их подвижности и подсчет затруднительны. Учет результатов реакции начинают с инак-тивированного комплемента. Подсчитывают 25-30 трепонем и отмечают, какое количество среди них подвижных и какое – неподвижных. Если в контроле содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 сосчитанных, то такой опыт непригоден и его следует повторить. В пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвижности трепонем объясняется не иммобилизацией, а токсичностью сыворотки или недостаточно высоким качеством среды сохранения (зафязнение бактериями, примесь медикаментов и т. д.).