Различные списки Библии были доставлены в Острог также из Рима, из чешских земель, но наиболее полный экземпляр — Геннадиевская Библия — был привезен Михаилом Гарабурдой из Москвы.

Острожский научно-литературный кружок проделал огромную текстологическую работу по подготовке издания Библии. Тексты, переведенные с латыни, были сверены с греческими, часть их переведена заново.

Для печатания Острожской Библии первопечатник отлил новые шрифты, вырезал новые гравировальные доски.

Поначалу редакционный совет намеревался украсить Библию сюжетными гравюрами на металле. Эта сложная, трудоемкая и очень дорогая техника в те времена еще редко использовалась в Западной Европе, а в Восточной была практически неизвестна. Первопечатник начал переговоры с немецким мастером — гравером из города Вроцлава Блазиусом Эбишем. Между ними было заключено соглашение, по которому Эбиш обещал «Ивану Хведоровичу, проживающему в Остроге русскому типографу ясновельможного воеводы Киевского Константина», «вырезать на медных пластинах как можно лучше, насколько сумеет, изображения к истории святой Библии соответственно последовательности эпизодов и глав в количестве ста пятидесяти». За работу он запросил 700 золотых, а кроме того, наниматель обязывался все время, что мастер будет работать, обеспечивать его самого, его семью и подмастерьев питанием.

Предполагалось, что Эбиш приедет во Львов ко дню святой Агнешки — 21 января 1579 года, — когда в городе устраивалась традиционная ежегодная ярмарка. Однако этот приезд был отменен, и Острожская Библия вышла без гравюр немецкого мастера. Почему издатели Библии отказались от первоначального замысла — неизвестно. Высказывались предположения, что плата, запрошенная Эбишем, показалась им слишком высокой. Однако издание финансировал князь Острожский, а для него уплатить 700 золотых не представляло никаких затруднений. Более вероятно, что у издателей вызвала сомнение сама идея оформить Библию сюжетными гравюрами. Возможно, они решили, что такое нетрадиционное для русских книг оформление, к тому же выполненное мастером-немцем, сделает Библию похожей на лютеранскую, и решили не рисковать. Острожская Библия была оформлена традиционными орнаментальными гравюрами-заставками на дереве работы самого Ивана Федорова.

В период подготовки Библии в жизни Ивана Федорова произошла непонятная и неприятная история.

14 мая 1577 года знакомый первопечатника, известный краковский врач Мартин Сенник, автор книг «Испытание лекарств», «Гербарий, или Описание здешних, иностранных и заморских трав, какую силу они имеют, и как ими пользоваться», послал во Львов ремесленнику Власу Замочнику письмо, в котором сообщал, что Иван Федоров должен был оставить Власу Замочнику и Семену Седляру 600 золотых для пересылки в Краков автору письма. «Вероятно, — писал Мартин Сенник, — он знал, что я на святого Станислава (8 мая) теперь уже прошедшего, должен был принимать гостей, которые по его надобности приехали из немцев на ту ярмарку. А так как посланная мне сумма от пана Ивана не дошла, а гости сами по моей просьбе, и полагаясь на мое слово, приехали, должен был я за собственный счет их вознаградить и в том понес немалый убыток».

Иван Федоров и Семен Седляр были вызваны в суд.

Иван Федоров «под присягой, подняв два пальца к небу, публично признал и сказал, что он дал 50 золотых Сеньке Седляру с тем, чтобы тот передал их краковскому бумагоделательному мастеру Лаврентию через доверенного Мартина Сенника, однако по причине слухов о татарском набеге доселе не выслал их и сберегает у себя». О 600 золотых «он с удивлением узнал из прочитанного письма». Первопечатник показал также, что «ничего не знает про каких-то людей из Германии, которые должны были прибыть в Краков по его делу». Никаких купцов из Германии он не приглашал и денег Сеннику не обещал. То же показал Семен Седляр, сказав, что сам он Мартина Сенника никогда не встречал.

На этом дело и закончилось. Я. Д. Исаевич высказал предположение, что эта история как-то связана с переговорами Ивана Федорова с Эбишем. Однако кто был виноват в недоразумении, из-за которого почтенный краковский врач «понес немалый убыток» и, вероятно, навсегда рассорился с первопечатником — неизвестно.

В работе над Библией принимал участие и сын Ивана Федорова — Иван Друкаревич, как называли его по отцу, или Иван Переплетчик — по ремеслу, которое он к тому времени освоил. Иван Друкаревич женился на дочери львовского горожанина Татьяне Анципорковне и в 1580 году с молодой женой переехал к отцу в Острог. Вероятно, Иван Друкаревич, несмотря на молодость, был искусным мастером, поскольку ему первопечатник поручил переплетать Острожскую Библию.

Острожская Библия вышла в свет в августе 1581 года. Ее издание часто называют издательским подвигом Ивана Федорова.

Выход в свет первой полной славянской Библии был делом огромного общественного значения. E. Л. Немировский пишет: «Острожская Библия сыграла исключительно большую роль в истории культуры восточнославянских народов. В свое время она явилась для Запада своеобразным свидетельством идеологической и нравственной зрелости русских, украинцев и белорусов. Перевод Библии на национальный язык и издание ее на этом языке говорили о росте национального самосознания, укрепления позиций родного языка».

Острожская Библия представляет собой книгу большого формата, состоящую из 628 листов с текстом, размещенным в два столбца. На обороте титульного листа помещены герб князя Острожского и торжественные, по-старинному тяжеловесные вирши, сочиненные Герасимом Смотрицким. Восхваляя князя Острожского как инициатора издания Библии, Смотрицкий подчеркивает значение этого издания в деле сохранения национальной самобытности и борьбы против католической экспансии: