В июле 1795 года Гумбольдт получил отпуск и отправился со своим другом Фрееслебеном в Италию. В продолжение двух месяцев они пешком ходили по горам, изучая геологию и растительность. В особенности их заинтересовали вулканические ландшафты Италии и Сицилии; на обратном пути они изучали Швейцарские и Савойские Альпы.

Наряду с геологическими и минералогическими исследованиями Гумбольдт в этот период создает крупные работы по ботанике и физиологии растений и по животному электричеству.

В 1792 году вышла из печати его крупная работа «Афоризмы из химической физиологии растений», а год спустя «Флора Фрейберга». Работы эти получили высокую оценку в научных кругах различных стран.

Некоторые выводы Гумбольдта значительно опережали научную мысль того времени и были подтверждены много лет спустя. Так, например, обнаруженные в растениях минеральные соли в то время считали случайной примесью. Гумбольдт доказал, что они являются необходимыми составными элементами пищи растений. Только после работ химиков Соссюра в Либиха мнение это утвердилось в науке.

В 1792 году Гумбольдт ознакомился с открытием итальянского физика Луиджи Гальвани о животном электричестве и с работами другого итальянского физика — Александра Вольта, который отвергал существование животного электричества.

Гумбольдт решил опытным путем проверить противоречивые выводы этих ученых и дать свое заключение. Он с большим самоотвержением начал экспериментировать на своем теле. На его спине врачом делались раны и гальванизировались различными способами. Своими экспериментами Гумбольдт подтвердил выводы Гальвани и высказал мнение, что возникновение электрических токов в теле животных вызывается нервной деятельностью. Только через 50 лет этот вывод был подтвержден французским ученым Дюбуа-Реймоном.

Результатом этих исследований явилось двухтомное сочинение «Опыты над раздраженными мускульными и нервными волокнами», напечатанное в 1797–1799 годах. Это сочинение произвело сенсацию в ученом мире. Гумбольдта стали считать основоположником физиологии нервной деятельности.

Геология, ботаника, физиология растений, химия, физика, наблюдения и эксперименты — все это в его трудах тесно связывалось между собой. Он вел переписку и полемику, из всех стран мира приходили к нему книги и статьи.

14 ноября 1796 года умерла мать Гумбольдта, которая не хотела отпускать его в путешествие. После похорон матери Гумбольдт сразу же вышел в отставку и решил в будущем жить исключительно для науки.

В том же году он поехал к брату Вильгельму в Иену, чтобы решить вопрос о разделе наследства. Здесь он близко познакомился с Шиллером и Гёте; последний в эти годы увлекался естествознанием. Гёте был в восторге от Гумбольдта. Они вместе слушали в университете лекции профессора анатомии Лодера, обсуждали проблемы геологии, физики, занимались экспериментами по физиологии растений. В письме к герцогу Веймарскому Гёте писал о Гумбольдте: «Он настоящий рог изобилия в отношении наук».

В феврале 1797 года Гумбольдт оставил государственную службу и стал деятельно готовиться к осуществлению давно задуманного путешествия.

Закупив все необходимое, Гумбольдт поехал в Италию, но задержался в Вене, чтобы закончить и сдать в печать до отъезда в путешествие рукописи своих трудов.

В Вене он встретился с товарищем по Фрейбергской академии Леопольдом фон Бухом. 17 октября 1797 года они переехали в город Зальцбург, где в продолжение пяти месяцев занимались проверкой инструментов, производили определения географических координат различных пунктов, вели геологические и метеорологические исследования.

В Зальцбурге Гумбольдт выработал план путешествия в Индию, но осуществлению его мешала война между Англией и Францией.

Здесь же Гумбольдт познакомился с лордом Бристолем, который собирался совершить путешествие в Египет. Бристоль предложил Гумбольдту поехать с ним, и тот дал согласие. Гумбольдт надеялся через Палестину, Сирию, Иран и Афганистан проехать в Индию.

Весной 1798 года из Зальцбурга Гумбольдт поехал в Париж, чтобы приобрести оборудование для экспедиции и выяснить политическую обстановку. В Париже он узнал, что Наполеон готовит экспедицию в Египет и что лорд Бристоль арестован в Италии, как британский осведомитель.

Гумбольдт озабоченно смотрел на Париж, который из города революции превратился теперь в город военных авантюр. Беспрестанные войны и политические неурядицы мешали организации больших научных экспедиций. В Париже Гумбольдт занимался научными исследованиями, чтением докладов и поисками возможности принять участие в какой-нибудь крупной экспедиции.

Здесь он познакомился с 70-летним мореплавателем Л. Бугенвилем, который совершил кругосветное путешествие в 1766–1769 годах. Бугенвиль составил план нового кругосветного плавания в южных широтах земного шара. Он предложил Гумбольдту участвовать в экспедиции вместе с натуралистами Мишо и Бонпланом. Но экспедицию доверили не Бугенвилю, а капитану Н. Бодену. Для кругосветного плавания были снаряжены три корабля, подобрана надежная команда из молодых и сильных людей. Но через 14 дней все надежды рухнули. Финансы Франции из-за войны были истощены, и Директорий не могла отпустить средства на экспедицию.