Разделение зеленого красителя листьев методом колоночной адсорбционной хроматографии

Разотрем в ступке 10 г богатых хлорофиллом листьев (например, молодых листьев крапивы), добавив к ним немного песка. Для нейтрализации кислоты, присутствующей в растении, можно добавить на кончике шпателя карбонат кальция. К полученной кашице в сосуде, который нужно надежно закрыть, прильем смесь 45 мл низкокипящего бензина (газолина), 5 мл бензола и 15 мл метанола. (Осторожно! Легко воспламеняется!)

Вместо смеси этих трех растворителей можно взять 50 мл пропанона (ацетона). Смесь выдержим в темном месте не менее часа, время от времени взбалтывая. Тем временем подготовим колонку с адсорбентом. Возьмем стеклянную трубку длиной 18–20 см с внутренним диаметром 8-15 мм, укрепим ее вертикально и закроем снизу пробкой, в которой просверлено отверстие. Сверху на пробку положим кусочек марли и слой ваты, чтобы порошкообразный адсорбент, который надо очень плотно утрамбовать стеклянной или деревянной палочкой, не высыпался из колонки. Насыплем в колонку сначала свежепрокаленную окись алюминия, так чтобы она заняла 2–3 см по высоте. Над этим слоем должен располагаться слой измельченного до тонкого порошка карбоната кальция высотой 4 см. (Можно кусочки мрамора или мела высушить нагреванием в фарфоровом тигле, а затем измельчить.) Еще выше поместим слой очень тонко размолотой высушенной сахарной пудры высотой 6 см. Можно приготовить колонку и проще, составив адсорбент всего из двух слоев. В этом случае нижний слой высотой 3 см должен состоять из свежепрокаленной окиси алюминия, а над ним, отделенный от него тонкой прослойкой ваты, должен располагаться слой непрокаленной окиси алюминия высотой 10 см. Опыт неплохо получится даже при заполнении трубки одной сахарной пудрой.

Отфильтруем раствор хлорофилла от остатков растительных клеток и песка. В проходящем свете фильтрат выглядит изумрудно-зеленым, а в отраженном свете обнаруживает великолепную красную флуоресценцию. Нам нужно еще отделить от фильтрата метанол. При встряхивании фильтрата с водой образуется два слоя. С помощью делительной воронки или простого отсасывания пипеткой можно отделить окрашенный слой бензола и бензина от бесцветного метанольно-водного слоя (Ни в коем случае не отсасывать ртом!

Об опасности метанола сказано ранее. Бензол — также сильный яд, отравляющий кровь.

Разрежение в пипетке создают с помощью груши или водоструйного насоса. Удобнее всего набирать жидкость в пипетку шприцем (без иглы), плотно соединенным с пипеткой кусочком резинового шланга. — Прим. перев.).

Затем соединим колонку с колбой для отсасывания, последнюю подключим к водоструйному насосу и пропустим через колонку несколько миллилитров бензина. Продолжая отсасывание, прильем в колонку раствор хлорофилла. Нельзя брать этого раствора слишком много, кроме того, он не должен быть слишком концентрированным. Мы увидим, что в колонке образуется несколько разноцветных зон. В заключение пропустим через колонку еще 10–15 мл смеси бензина с бензолом в соотношении 4: 1. При этом окрашенные зоны расширяются. Этот процесс называется проявлением хроматограммы (В качестве колонки можно также использовать бескрановую бюретку или стеклянную трубку, оттянутую в нижней части. В месте сужения удерживается кусочек ваты. Полезно иметь в виду, что лучшее качество разделения обычно получается при заполнении колонки не сухим, а «мокрым» способом, в этом случае порошок адсорбента размешивают наносят в колонку вместе с растворителем (в данном опыте — с бензином). Отсасывать нужно не слишком сильно, чтобы не нарушать равномерность слоя адсорбента. Без отсасывания качество разделения лучше, но опыт занимает слишком много времени. Лучше вместо отсасывания создавать слегка повышенное давление, подключая к колонке сверху надутую камеру от волейбольного мяча. — Прим. перев.).

Теперь мы обнаружим в колонке четыре зоны разного цвета. Верхняя, желто-зеленая зона содержит хлорофилл b сине-зеленая зона ниже — хлорофилл а. В слое окиси алюминия адсорбируются желтый ксантофилл и под ним — оранжевый каротин. Каротин знаком нам по цвету моркови, в которой он содержится Если колонка была заполнена только сахарной пудрой, то каротин не задерживается и в виде раствора попадает в колбу для отсасывания. Впрочем, это может получиться и при таком заполнении колонки, которое было описано в нашем опыте. Если столбик адсорбента осторожно вытолкнуть из колонки стеклянной палочкой, то можно разрезать его на отдельные зоны и извлечь из них различные красители органическими растворителями.

В 1944 г. английские химики предложили еще более простой метод хроматографии, который тоже позволяет обнаружить и разделить ничтожно малые количества веществ. По этому способу разделение проводится на полоске бумаги, по которой движется исследуемый раствор. Получим сами такую бумажную хроматограмму.

Разделение красителей из растений методом бумажной хроматографии

Вначале снова приготовим раствор красителя. Для бумажной хроматографии его понадобится меньше — всего 10–15 капель. Достаточно растереть два маленьких листочка и для извлечения из них красящих веществ добавить 2 мл пропанона (ацетона).

Правильно выбрать бумагу для хроматографии нелегко. Лучшие результаты получаются только при использовании бумаги из чистого хлопка. Выпускаются специальные сорта бумаги для хроматографии (быстрофильтрующая и медленно фильтрующая). При отсутствии такой бумаги придется удовлетвориться просто фильтровальной бумагой высокого качества. Из трех известных вариантов — восходящей, нисходящей и круговой бумажной хроматографии — выберем восходящую хроматографию. Вырежем из бумаги полоску шириной 1 см. На одном конце сделаем полоску поуже, чтобы получался вытянутый «язычок» (как на рисунке). Над тем местом, где полоска начинает сужаться, простым карандашом наметим линию старта. На середину этой линии нанесем одну за другой несколько капелек приготовленной нами вытяжки хлорофилла. Каждую следующую каплю можно наносить только после того, как высохнет предыдущая, и нужно следить, чтобы пятно на старте не получилось слишком большим. Поэтому раствор нанесем на бумагу пипеткой с тонко оттянутым концом. Для ускорения высушивания можно поместить полоску на нагретый кусок листового металла или асбеста либо выдержать ее в сушильном шкафу. Капли нужно наносить до образования на линии старта пятна интенсивного зеленого цвета. Подвесим полоску бумаги в пробирке так, чтобы язычок на 1 см был погружен в растворитель (петролейный эфир, толуол, бензин). Под действием капиллярных сил растворитель будет подниматься по бумаге, а вместе с ним будут подниматься и красители.

Но продвигаться по бумаге они будут с различной скоростью. Медленнее всех поднимается желто-зеленый хлорофилл Ь, быстрее — ксантофилл и еще быстрее — сине-зеленый хлорофилл а. С фронтом растворителя поднимается желтый или оранжевый каротин. Опыт занимает 2–3 часа.

Очень красивые хроматограммы получаются при исследовании вытяжек листьев другого цвета, например красных (краснокочанной капусты, лесного бука и т. д.). Обнаружение на этих хроматограммах зеленых и желтых пятен покажет нам что в таких листьях окраска красителей группы хлорофилла перекрывается интенсивной красной или фиолетовой окраской антоцианинов. В цветках васильков содержатся, например, фиолетовый цианидин и красный пеларгонидин. Оба эти вещества входят в состав природных красящих веществ ряда антоцианинов. Для их разделения цветы обрабатывают спиртом. Полученный раствор, содержащий эти красители, наносят на бумагу для хроматографии. После высушивания язычок бумажной полоски погружают в 2 соляную кислоту.