Монастырские кельи и прочие строения разобрали, но церковь Спаса Преображения на Бору была восстановлена и стала великокняжеским придворным храмом. С Постельным крыльцом дворца его соединяла лестница. Именовать церковь стали «Верховою», или «Спасскою на Царском дворе»; впоследствии храм получил статус придворного собора. Он был центром особой сакральной зоны, недоступной иностранцам. Павлу Алеппскому, автору описания путешествия Антиохийского патриарха Макария в Россию в царствование Алексея Михайловича, удалось проникнуть на «особую внутреннюю дворцовую площадку, недоступную для посторонних… На ней малая церковь, скрытая и вросшая в землю, в честь божественного Преображения; как говорят, она была первой, построенной в Москве».

В XVI–XVII веках в храме совершались ранние обедни для дворцовых слуг: «ключники, и стряпчие, и сытники, и приспешники, и повары тут приходят, и рано для их служба живет, чтоб отправясь, шли всяк на свой приспех, к царскому столу готовить». Стоглавый собор (1551) предписывал: «как час ударит дни, звонити и пети обедни на другом часу у Спаса на царском дворце».

Жизнь многих исторических личностей связана в эту эпоху со Спасом на Бору. Протопоп собора Симеон был духовником удельного князя Андрея Старицкого — и был послан великим князем в погоню за его духовным сыном, когда государь решил «поймать» мнимого заговорщика. В середине XVI века протопопом собора некоторое время служил известный писатель той эпохи, автор «Повести о Петре и Февронии» Ермолай-Еразм. В храмовый праздник здесь обычно служил патриарх. В летописях отмечено, что ночью с 24 на 25 августа 1530 года в Москве поднялся невиданный ветер, началась гроза, а потом сами собою зазвонили колокола Спасского собора. В эту ночь родился Иван Грозный. В 1652 году на место настоятеля храма приглашали еще не опального протопопа Аввакума, «да бог не изволил», замечает он в «Житии». Из деятелей позднего средневековья известен спасский иеродиакон Афанасий Иванов, участник общественно-идеологической полемики между «мудроборцами» и «латиномудрствующими», в 1680-е годы выступивший с «Обличением на новопотаенных волков», которое разошлось по Москве в десятках рукописных копий.

В 1812 году Спасский собор пережил разорение; в алтаре французы хранили сено, солому и овес для личных лошадей Наполеона, часть храма стала конюшней, часть — солдатской казармой. При этом в тайниках собора лежали сокровища из кремлевских храмов, спрятанные перед приходом Наполеона — французы их не обнаружили. После возобновления, в 1817 году, он был приписан к дворцовому храму Спаса Нерукотворного и потерял статус собора, чего простые москвичи не заметили и называли Спас на Бору по-старому, собором.

В XIX веке в храме ежедневно совершалась служба кремлевским духовенством. Собор был приходским храмом для всех дворцовых служащих. 12 августа из Спасского храма направлялся крестный ход в Успенский собор. В апреле 1896 года в храме торжественно отметили 500-летие со дня кончины св. Стефана Пермского.

Почтенный собор был очень популярен среди московских невест, так как один из его престолов был посвящен Трем исповедникам — Гурию, Самону и Авиву, считавшимся покровителями невест. Ежегодно 15 ноября в день Трех исповедников, как свидетельствуют мемуаристы, «целые вереницы девиц направлялись в церковь Спаса на Бору в Кремле, и там служились молебны. Особенно усердными были те невесты, которые почему-либо уже более или менее долго ожидали появления претендента на их руку и сердце».

По свадебному поводу Спасская церковь появляется в знаменитых мемуарах А. О. Смирновой-Россет, близкой знакомой А. С. Пушкина. Вот что пишет она о свадьбе своей подруги фрейлины Анны Тютчевой, выходившей замуж за славянофила Ивана Аксакова: «Соболевский при сей верной оказии ради красного словца написал четверостишие: Иван и Анна венчаются у Спаса на Бору, древнейшей церкви в Москве. Тургенев Александр, которого спрашивали, что нового по Москве: Спаса на Бору взяли ко двору. И точно, некогда окруженный густым бором бедный Спас окружен теперь фрейлинскими покоями».

Каменная церковь 1330 (по другим данным, 1328–1329) года, как предполагал И. Забелин, сохранялась в основе собора Спаса на Бору, несмотря на все обновления и переделки храма в XIV–XVII веках. Это была четвертая по времени основания каменная церковь Москвы. Известно о ней немного. Кубический объем четырехстолпного, первоначально одноглавого храма (сторона куба — не более 6 сажен), сложенный из белого камня, внутри был темен и невелик. Есть сведения о сооружении в 1350 году каменного притвора собора, в 1473 году переделанного в трапезную. При сносе собора в 1930-х годах нашли фрагменты первоначального резного фриза из белого камня: растительный орнамент с изящным рисунком. Специалисты отмечают близость этого фриза с убранством сербских храмов того времени и влияние, оказанное им на декор раннемосковских храмов XIV–XV веков. Историк русской архитектуры А. М. Павлинов (1894) считал, что Спас на Бору выстроен «под влиянием владимирских церквей», указывая на трехфронтонное покрытие стен и форму дверных арок.

При сыне Ивана Калиты Симеоне Гордом в 1345–1346 годах собор был расписан «казною и велением» его жены Анастасии. Трудились над фресками русские мастера под руководством неких учившихся у греков Гойтана, Семена и Ивана. Согласно последним гипотезам историков древнерусской живописи, этот великокняжеский мастер Иван является отцом Андрея Рублева, который в одном из средневековых документов назван «Ивановым сыном»; в сохранившихся работах обоих художников находят общие приемы и стилистическое сходство. В соборе хранился драгоценный оклад с иконы Спаса Нерукотворного, которой брат византийского императора Фома Палеолог благословил свою дочь Софию на брак с Иваном III.

XVI столетие приносит нам известия о многочисленных перестройках храма. В 1527 году его приказал обновить (по некоторым источникам — заново построить) великий князь Василий Иванович. Тогда же появились новые приделы. Историк П. В. Сытин говорит об обновлении храма после пожара 1547 года; перестраивался Спас на Бору и после пожара 1554 года. Иван Грозный после похода на Новгород велел пристроить к собору придел Трех Святителей — такой же был в новгородском Софийском соборе.