При необузданности нрава царицы, не терпевшей ни малейшего препятствия в стремлении к ненасытному тщеславию, столкновение между нею и святителем не заставило себя долго ждать, и оно произошло через два месяца по возвращении Златоуста на свой престол по следующему случаю. Чувствуя, что именно она глава государства, а не малодушный и ничтожный Аркадий, Евдоксия заявила притязание на небывалую для императриц почесть — сооружение особой колонны, увенчанной ее серебряным изображением, на самой важной площади столицы — около церкви св. Софии. Это необузданное честолюбие Евдоксии возбудило даже негодование на Западе, и Гонорий счел своим долгом предостеречь своего брата Аркадия от подобного нарушения древних обычаев. Но Евдоксия ничего не хотела знать, и колонна с ее серебряной статуей на вершине была поставлена при всевозможных торжествах и ликованиях.

Вследствие близости колонны к церкви шум этих непристойных торжеств с языческими церемониями и плясками делал невозможным самое богослужение, и, так как они продолжались несколько дней, святителю не могло не показаться все это явным и даже намеренным оскорблением святыни. Сначала он хотел через префекта устранить это кощунство; но когда префект не оказал ему в этом отношении никакого содействия, то он произнес резкую обличительную беседу, которую, по свидетельству историков, начал знаменитыми словами: «Опять беснуется Иродиада, опять мятется, опять рукоплещет и пляшет, опять главы Иоанновой ищет».

Доносчики и враги Иоанна не преминули со злорадством довести об этом до сведения царицы, истолковав эти слова в том смысле, что в них она сравнивается с Иродиадой, и Евдоксия пришла в полное неистовство, с плачем жаловалась царю на нанесенное ей оскорбление и требовала, чтобы вновь был созван собор для низвержения невыносимого для нее иерарха. К Феофилу полетели от нее письма, в которых она умоляла его вновь приехать в Константинополь и докончить низвержение Иоанна. Тот, конечно, рад бы был исполнить просьбу царицы, так совпадавшую с его собственным желанием; но полученный им раньше урок, когда он едва не побит был камнями от народа, заставил его быть поосторожнее, и он, не желая вновь подвергать себя опасности, отправил вместо себя трех епископов — заместителей, снабдив их необходимыми наставлениями, и между прочим канонами, на основании которых можно было осудить Иоанна.

Эти каноны были арианского происхождения, составленные некогда арианами на Афанасия Великого, и, следовательно, не имели силы для православной церкви; но так как в них заключалось одно постановление, весьма пригодное в данном случае, а именно о том, что епископ, раз низвергнутый собором, не может вновь занимать престола без отмены прежнего постановления другим большим собором, то Феофил ничтоже сумняшеся и настаивал на применении этого правила к Иоанну, который-де вновь занял свой престол просто по распоряжению царя и воли народа, без правильного соборного определения.

Собор действительно опять составился почти из тех же епископов, которые заседали и «При дубе», и, конечно, произнес новое осуждение на Иоанна, обвиняя его именно в нарушении указанного канона. Осуждение это было вдвойне незаконно, потому что в данном случае канон, составленный еретиками с явно злонамеренной целью — погубить великого поборника православия, был неприменим и потому, что в действительности Иоанн по возвращении из ссылки был оправдан от осуждения его придубским собором со стороны большого собора, состоявшего из 66 епископов. Но злоба врагов не признавала никаких доводов, и Иоанн был объявлен низвергнутым, и это постановление утверждено императором.

Таким образом, над главою многострадального Иоанна опять разразился гром: он вновь был в опале и изгнан из своего сана. Наученный горьким опытом прежнего случая, император, однако, опасался теперь прибегнуть к насилию над низвергнутым святителем и хотел заставить его удалиться добровольно, стараясь при всяком случае доказывать ему, что он больше не архиепископ и незаконно занимает престол. Так, в праздник Рождества Христова 403 года император не хотел принять от него св. причастия. В таком неопределенном положении дело оставалось до самой Пасхи.

Наконец царь, наущаемый Евдоксией, которая не давала ему покоя, пока еще оставался на своем престоле ненавистный ей святитель, порешил к светлому празднику Христову совсем удалить Иоанна и послал ему приказ оставить церковь. Св. Иоанн, исполненный сознания своей правоты и пастырского долга, отвечал, что он не оставит церкви, которая вверена ему Христом Спасителем, чтобы не понести ответа за самовольное оставление ее. Пусть изгонят его силою, и тогда на него не падет вина эта. Царь заколебался от такой стойкости святителя; но, видя над собой неумолимую тиранию Евдоксии, порешил так или иначе покончить с этим тяжелым делом.

Придворному сановнику Марину поручено было силою удалить Иоанна из церкви, где он уже готовился совершить св. крещение над 3 000 оглашенных. Сановник исполнил приказ с полицейской точностью, и светлый праздник был омрачен безобразными сценами дикого насилия (16 апр. 404 г.).

Силой ворвавшись в церковь, полуварварские воины под начальством язычника Луция начали беспощадно громить все, предаваясь всяким буйствам и грабежу. Те, кто пытался защитить святителя, были избиты, духовенство выгнано из храма, и даже полураздетые оглашенные, уже приготовившиеся для крещения, выгнаны были на улицу; евхаристия осквернена и священные сосуды разграблены. Мерзость запустения водворилась на месте святом, и до глубины души огорченный святитель был заключен в патриаршем доме, где он и оставался еще два месяца под домашним арестом. Положение его с каждым днем становилось все тяжелее, и он находил себе единственное утешение в молитве да в обществе близких ему лиц, среди которых истинным ангелом-хранителем для него была благочестивая диаконисса Олимпиада.