Юная чета столкнулась с более серьезными проблемами, когда 16 ноября Франциск II рано вернулся с охоты в окрестностях Орлеана из-за головокружения и звона в правом ухе. В воскресенье он упал в обморок в церкви, головная боль стала постоянной, а из уха несколько раз вытекала жидкость. Франциск II всегда страдал от экземы, причем на его лице появлялись красные пятна, а также от респираторных заболеваний, из-за которых у него шел дурной запах изо рта. Все это ослабило его организм, который больше не мог сопротивляться болезни. Новое воспаление проявилось опухолью «размером с орех», а когда врачи осмотрели его левое ухо, то обнаружили открытый свищ, из которого вытекал гной. Было очевидно — король умирает. В письме от 4 декабря Екатерина признала этот ужасный факт, указав при этом, что у Франции нет недостатка в законных наследниках престола — «и все они мои дети». Однако брату Франциска II Карлу было всего десять лет, поэтому необходимо было решить проблему регентства. Екатерина блестяще справилась с этой задачей, вызвав к себе Антуана де Бурбона, короля Наваррского, ставшего к тому времени гугенотом, но являвшегося старшим принцем крови. Она немедленно обвинила его в измене. Зная, что его брат Конде уже получил смертный приговор, а также будучи «от природы покладистым и уступчивым», король Наваррский предложил Екатерине регентство при условии, что она пощадит его, и она тут же согласилась. Екатерина заставила братьев Гизов обнять Антуана в знак прощения и приказала освободить Конде, нейтрализовав тем самым своих врагов и ничего не потеряв.

Этот ловкий ход знаменовал конец власти Гизов. Екатерина мудро отошла в сторону перед тем, что справедливо сочла необоримой силой братьев Гизов, подкрепленной влиянием Марии на Франциска II, однако теперь у нее появился шанс, и она за него ухватилась. Девочкой она читала не «Амадиса Галльского», а «Государя» Макиавелли и «Придворного» Кастильоне, где могла встретить следующие строки: «Обязанностью хорошего придворного является знать натуру и склонности государя, так что в зависимости от обстоятельств он легко сможет обрести его благоволение». Екатерина взялась за дело с энтузиазмом. Позднее английский посол говорил о ней: «Правда в том, что она любит и ненавидит в зависимости от собственной выгоды… Эта женщина извлекает выгоду из любого случая и стремится добиться своего невзирая на добро и зло». Другими словами, она была настоящим прагматиком по сравнению с романтичной Марией.

Кардинал приказал служить искупительные мессы, и по всей Франции молились за короля. Доктора сделали в ухе Франциска И прокол, что привело к временному облегчению. Мария постоянно ухаживала за ним. 3 декабря во внутреннем ухе короля образовался абсцесс, распространившийся на мозговые оболочки, 5 декабря он уже был без сознания. В тот же день он «отдал Богу душу», и королем Франции стал десятилетний Карл IX. В присутствии Карла и его матери кардинал Лотарингский сломал печати Франциска И. Через четыре дня после своего восемнадцатого дня рождения Мария стала вдовой короля.

Череп покойного короля вскрыли; доктора утверждали, что весь его мозг сгнил и вылечить его было невозможно. Мария находилась в полной прострации, напоминавшей состояние Екатерины после смерти Генриха II. Она соблюдала полный траур, не выходила из комнаты, стены которой были затянуты черным крепом, и беспрестанно плакала. «Она была исполнена скорби, подобающей жене, и у нее на то была справедливая причина, ведь она ухаживала за ним во время его болезни, усердно выполняя все тягостные обязанности… Она чувствует себя нехорошо, но вне опасности». 8 декабря Джованни Суриан описал ее состояние в письме своему господину, венецианскому дожу:

«Постепенно все забудут о смерти покойного короля, все, кроме его молодой жены, а теперь вдовы. Ведь она столь же благородна, сколь красива и изящна. Мысли о столь раннем вдовстве, о потере супруга, великого короля, так любившего ее, а также и о том, что она лишилась французской короны и не имеет большой надежды вновь обрести корону Шотландии, ее единственного достояния и приданого, столь угнетают ее, что она не может утешиться. Постоянно обращенная мыслями к своим несчастьям, вся в слезах, страстно и горестно сетующая, она внушает всем великую жалость».

Мария знала: как в свое время Диане де Пуатье, ей после смерти Франциска II придется вернуть все подаренные им драгоценности, так что 6 декабря были составлены две описи. Драгоценности в основном состояли из многочисленных бриллиантов и рубинов, вставленных в ожерелья и распятия, были также эмали с буквой «Р». Список занимает три страницы и подписан «Карл» — возможно, это первый документ, подписанный им в качестве монарха. Екатерина добавила к нему расписку в получении драгоценностей. Был также составлен перечень личных слуг Марии, показывающий, что четыре Марии по-прежнему были с ней. Помимо них в списке были указаны 286 придворных и слуг. Немногие из них потребовались Марии во время ее пятнадцатидневного траура, ведь к ней допускались лишь ближайшие родственники, однако послы и придворные перешептывались, строя бесконечные предположения.

Мария теперь была восемнадцатилетней женщиной, теоретически способной к деторождению — хотя этого еще не доказала, — и вдовствующей королевой. Секретный договор Фонтенбло теперь утратил свое значение, однако Мария имела огромные земельные владения во Франции и могла претендовать на королевские доходы в Шотландии. 20 декабря мальчик-король Карл IX подписал приказ выплатить Марии ежегодную вдовью долю в 60 тысяч ливров из доходов ее герцогств Турень и Пуату. Таким образом, «за утратой последовала бедность». Это неточно, поскольку она по-прежнему была одной из богатейших женщин Франции, даже не считая владений в Шотландии, а ее рука — великим призом для любого, кому удалось бы на ней жениться.

Придворные не прекращали рассуждений о ее браке с того момента, когда стало понятно, что Франциск II умирает. Мария сидела у постели мужа, но Екатерина и ее братья были слишком заняты проблемой наследования престола и выбора нового мужа для Марии, чтобы быть рядом. Для Екатерины было типично стоически принять неизбежное и немедленно идти дальше. Сначала предположили, что, получив папскую диспенсацию, Мария могла бы выйти за своего шурина Карла IX, но Екатерина решительно отвергла эту идею.