В первые годы работы в университете училось очень мало студентов. Основной набор был произведен из выпускников Харьковского коллегиума, так как воспитанники народных училищ не изучали латинский язык, необходимый для поступления в университет.

Распорядок учебы и жизни студентов регламентировался уставом 1804 года, по которому студенты делились на три группы: своекоштных, в основном выходцев из среды зажиточных дворян, казеннокоштных и вольнослушателей.

С целью предупреждения «вольнодумства» администрация университета внимательно следила за поведением студентов. В случае нарушения утвержденного распорядка виновного ожидали карцер, исключение из университета и другие наказания, вплоть до отдачи в солдаты.

Наряду с уставами 1804 и 1835 годов в университете вырабатывали свои правила, утверждавшиеся министром просвещения. Женщинам в Харьковском университете, как и в других университетах России, учиться не разрешалось.

В 1808 году состоялся первый выпуск Харьковского университета. Из 57 поступивших дипломы об окончании курса наук получили 26 человек. Это событие было отмечено торжественной церемонией. Выпускники университета читали свои сочинения перед собравшейся публикой.

В университете учились и работали выдающиеся деятели науки и культуры нашей страны. Здесь защитил дипломную работу биолог И. И. Мечников, учились композитор Н. В. Лысенко, писатель, поэт и драматург М. П. Старицкий, художник Г. И. Семирадский и другие, Ректором университета в первой половине XIX века был украинский писатель П. П. Гулак-Артемовский. В университете работали такие ученые, как основатель физической химии Н. Н. Бекетов, математики М. В. Остроградский, В. А. Стеклов, историк Д. И. Багалей, филолог А. А. Потебня, биохимик А. Я. Данилевский и другие.

Прогрессивные преподаватели университета проводили значительную культурно-просветительную работу, организуя для населения чтение лекций, вечерние чтения для женщин и другие мероприятия.

Университет имел значительную научно-вспомогательную базу — библиотеку, лаборатории, обсерваторию, ботанический сад. Библиотека университета была основана в 1804 году В. Н. Каразиным, который отдал ей в дар собственное собрание книг. Библиотеке было отведено помещение в главном здании университета, где она находилась по 1835 год.

В 1804 году на территории университетского двора был заложен ботанический сад, вскоре перенесенный на окраину города.

Открытие университета сыграло большую роль в развитии украинской литературы и журналистики. В 1804 году при университете была открыта одна из первых типографий города, где печатались газеты, журналы и книги. Первая газета «Еженедельник» начала издаваться в 1812 году. Она была основана по инициативе группы преподавателей университета. В 1816 году вышел журнал «Украинский вестник», в числе редакторов которого был Г. Ф. Квитка-Основьяненко. Совместно с профессором И. И. Срезневским и студентом В. Масловичем он основал журнал «Харьковский демокрит». В 1817 году вышел первый номер журнала «Украинский домовод», посвященный вопросам сельского хозяйства. С 1817 по 1824 год с некоторыми перерывами в университетской типографии печаталась газета «Харьковские известия». Направление ее вызвало беспокойство правительства, и по настоянию министра просвещения Голицына газета была закрыта. Значительно позже, уже в 30-х годах XIX века, увидели свет литературные сборники «Украинский альманах» (1831 год) и «Утренняя звезда» (1833 год). С 1838 года стала регулярно выходить газета «Харьковские губернские ведомости». В первой половине XIX века на Университетской горке появилось несколько новых сооружений, построенных в стиле русского классицизма. В 1820 году рядом с Покровским собором и зданием коллегиума развернулось строительство архиерейского дома (сейчас здесь находится Исторический музей). В 20-х годах началась перестройка существовавших и возведение новых университетских зданий. Напротив главного корпуса университета по проекту профессора архитектуры Харьковского университета Е. Васильева, ученика знаменитого русского зодчего Д. Кваренги, в январе 1823 года началось сооружение нового корпуса, в котором разместилась университетская церковь. В ней находились иконы работы академика В. Л. Боровиковского и художника А. Г. Венецианова. В этом же корпусе были построены актовый зал, а также книгохранилище, читальный зал и другие помещения для университетской библиотеки.

Вместо колокольни Успенского собора, построенной в 1688 году, в мае 1821 года началось возведение новой. Проект ее также был разработан Е. Васильевым и утвержден известным архитектором академиком В. П. Стасовым. Колокольня строилась в честь победы русских войск над французскими захватчиками в 1812 году. Строительство ее продолжалось более 20 лет, до 1844 года, сначала под руководством автора проекта, а после его смерти — архитектора А. Тона. Колокольня Успенского собора — одно из наиболее высоких сооружений этого типа. Ее высота 89,5 метра, глубина фундамента— 10,5 метра. На колокольне был установлен колокол весом 1003 пуда. В 1862 году механик Эдельберг установил на ней большие часы, изготовленные по заказу в Париже. Колокольня построена в стиле русской классической архитектуры.

В 1853 году началась перестройка Присутственных мест, в результате чего здание совершенно изменило свой облик.

На Университетской горке в 1870 году был открыт музей изящных искусств университета, который располагал коллекцией в 10 тысяч экспонатов. В музее было до 280 картин русских и итальянских художников, в том числе М. К. Клодта, И. М. Прянишникова, И. К. Айвазовского, И, И. Шишкина. Здесь устраивались выставки картин художников-передвижников. В ноябре 1876 года в актовом зале университета была открыта 5-я художественная выставка, на которой экспонировались картины А. П. Боголюбова, Г. Г. Мясоедова, А. И. Куинджи, В. Е. Маковского и других.

В начале XX века на Университетской горке появилось еще одно здание научно-просветительного назначения. В 1902 году на месте университетских клиник — хирургической и акушерской — было закончено сооружение нового здания библиотеки университета (автор проекта архитектор В. Величко), в котором до наших дней находится ее филиал.

Университетская горка имеет славную революционную историю. Еще в 1825—1826 годах среди студентов университета распространялись рукописи стихотворений В. Ф. Раевского «К друзьям», А. С. Пушкина «Чаадаеву», а также поэма студента Розальона-Сошальского «Рылеев в темнице», автор которой призывал к борьбе против самодержавия. В 1856—1858 годах в Харьковском университете существовало тайное общество демократической молодежи во главе со студентами Я. Н. Бекманом, П. В. Завадским и М, Д. Муравским, ставившее своей целью ликвидацию самодержавия, установление республики и освобождение крестьян от крепостной зависимости. Общество занималось распространением запрещенной в России литературы, сочинений Пушкина, Лермонтова, Шевченко и Герцена. Участники тайной организации писали и распространяли в городе пародии по поводу заключения Парижского договора, тысячелетнего юбилея России, а также острые памфлеты, в которых зло высмеивали царизм и руководство университета.

В 1900—1902 годах студенты университета вместе с рабочими города участвовали в целом ряде революционных выступлений.

Осенью 1905 года, когда в ходе всеобщей политической забастовки пролетариат России перешел к наиболее острой форме политической борьбы — баррикадным боям, рабочие и студенты Харькова начали строительство баррикад на Университетской горке.

10 октября по тревожному гудку паровозостроительного завода прекратили работу все предприятия города. Началась грандиозная политическая забастовка. Тысячи людей организованными колоннами вышли на улицы. В университете, на Конной площади, в районе железнодорожных мастерских состоялись бурные митинги Вечером 10 октября после обстрела Университетской горки казаками было принято решение о сооружении баррикад.