Точно таким же образом при точной проверке оказался недостигающим цели и второй метод Гамарстена. Он, как известно, начинается с многократного взбалтывания искусственного сока с порошком углекислого магния, при этом, по автору, пепсин должен был из жидкости увлекаться порошком, а химозин оставаться в жидкости, и затем следовала дальнейшая процедура очищения химозина. Мы проделали первую фазу методики с натуральным желудочным соком и видели то, что было перед глазами у Гамарстена. Фильтрат (3-й, 4-й и 5-й), хотя и меньше нормальной жидкости, но все же значительно быстро свертывал молоко, между тем как подкисленный до нормальной кислотности (0.5) без разжижения или только при малом разжижении совершенно не переваривал сырого фибрина даже за целые сутки. Однако стоило только разбавить фильтрат в 5-10 раз кислотой 0.1-0.2 для того, чтобы растворяющее действие фибрина обнаружилось совершенно отчетливо. И сколько раз мы ни взбалтывали наш предварительно нейтрализованный сок с углекислым магнием, мы не могли получить такого фильтрата, который при указанных условиях был бы лишен растворяющего действия на фибрин. Таким образом исчезнувший было параллелизм обоих действий для нас восстановился и мы было сочли себя удовлетворенными. Впоследствии, когда мы вместо параллелизма стали настаивать на пропорциональности, хотя бы приблизительной, этот пункт представил нам огромные затруднения и вызвал было даже в нас горькие сомнения относительно основного нашего положения, хотя это было в конце длиннейшего ряда фактов, нами полученных и до тех пор нам благоприятных. Когда мы попробовали более точно сопоставить молоко свертывающее и белок растворяющее действие фильтрата после взбалтывания с углекислым магнием, мы не могли не видеть огромной непропорциональности в обоих действиях. В то время как молоко свертывающее действие фильтрата указывало на уменьшение фермента в несколько раз, самое большее - в несколько десятков раз, по белок растворяющему действию фермента в жидкости оставалось в несколько сот и даже тысяч раз меньше. Мы обратили внимание на все мыслимые для нас обстоятельства. Мы определили и устранили задерживающее влияние на растворение того хлористого натрия, который образовался при нейтрализации сока. Мы определили и приняли во внимание благоприятствующее свертыванию молока действие того небольшого количества углекислого магния, которое растворялось в нашей жидкости при взбалтывании. Мы испробовали всякие степени кислотности, но факт в общем оставался прежним. Указанные меры изменяли результат только очень незначительно. Однако при этом постепенно накоплялись наблюдения, направлявшие мысль в надлежащий пункт. Титруя последовательные фильтраты, мы заметили, что их щелочность (вследствие небольшого растворения углекислого магния с щелочной реакцией) постепенно возрастает до известного предела, а с нею вместе понижалось белок растворяющее действие фильтрата. Это наводило на мысль: не играет ли в данном случае роль именно щелочность фильтрата? Поэтому прежде всего мы обратились к осадку углекислого магния после взбалтывания: действительно ли с ним увлечен из жидкости пепсин? Растворив этот осадок в соляной кислоте, разжижив его в надлежащей степени, чтобы устранить задерживающее действие хлористого магния, и подкислив соответственно, мы легко и точно на многих опытах убедились, что значительного захватывания пепсина осадком не происходило. Полученный раствор обнаруживал ничтожные следы растворяющего и молоко свертываютего действия, сравнительно с фильтратом. Стало действительно ясно, что механизм наблюдавшихся явлений в первой фазе гамарстеновского метода совершенно не тот, каким его представляли до сих пор. Это было давно известное разрушение фермента щелочью, разрушение или какое-то химическое изменение фермента под влиянием щелочи. Но если свойства фильтрата и были результатом действия щелочи, то все же, ввиду факта расхождения наших действий в фильтрате, приходилось думать так, что щелочь сильнее разрушает фермент, растворяющий белок, чем фермент, свертывающий молоко. Однако, принимая во внимание некоторые особенности, бросившиеся нам в глаза, когда мы занимались опытами с разрушающим действием щелочей на ферменты желудочного сока, мы продолжали стоять на своей точке зрения и старались добиться восстановления пропорциональности между обоими действиями, которая нам так упрямо не давалась. Наконец наше упорство было награждено: при, повидимому, совершенно ничего не значащей вариации опыта наш фильтрат проявил, наконец, растворяющее белки действие, нисколько не меньшее, а скорее большее, чем какое можно было ожидать на основании его молоко свертывающего действия. До сих пор мы Фильтрат, сделавшийся щелочным от взбалтывания с углекислым магнием, для переваривания сразу делали кислом до известной степени. Теперь же мы сперва его только нейтрализовали, таким оставляли стоять некоторое время и лишь затем подкислили до той же степени. И в этом-то фильтрате обнаружилось давно желанное значительное растворяющее действие (табл. 16).

Таким образом (табл. 16) и в этом приеме Гамарстена не оказалось ни малейшего намека на разделение фермента. Такой результат переисследования первой фазы приема естественно исключал надобность изучения второй фазы.

Самый же факт, обнаружившийся неожиданно ири этом, конечно, был достоин всяческого внимания. Мы имели перед собою под влиянием щелочной реакции переход фермента из деятельного состояния в недеятельное, из явного в скрытое, причем теперь обратный переход - из недеятельного в деятельное состояние - требует некоторой продолжительности нейтральной реакции среды (каковая и делалась молоком). Специально относительно этого пункта нами было сейчас же поставлено несколько опытов, один из которых приводим здесь (табл. 17).

При этих опытах нельзя не заметить, что при подкислении щелочной жидкости в один прием жидкость мутится и дает осадок, чего не бывает в случае, когда подкисление ведется в две фазы, c значительной остановкой (в несколько часов) на нейтральной реакции. Так как ясно, что факт стоит в ближайшем отношении к различным вопросам, касающимся фермента: действия щелочей, различного состояния фермента и т. д., то его изучение составило предмет дальнейшего и сейчас ведущегося в лаборатории исследования.

Весь изложенный материал, как нам кажется, отнимает всякую почву у ходячего мнения, что белки растворяющее и молоко свертывающее ферментные действия принадлежат особым ферментам. Факт тот, что эти действия никогда прочно не разделимы ни в организме, ни вне его ни при каких условиях. Есть, понятно, еще некоторые частные указания на прочную раздельность действий, но, не проверив их еще до сих пор, мы считали себя, однако, вправе не придавать им особенной силы ввиду обнаруженных нами недостатков современной методики сравнения этих действий.

Но мы давно уже остановились на общем вопросе: не противоречит ли нашему выводу, что оба исследуемые действия принадлежат одному и тому жерменту, то обстоятельство, что эти действия обнаруживаются по двум различным правилам зависимости от количества фермента? Это же представлялось существенным возражением против нашего взгляда и Гамарстену, что мы прочли уже во время писания этой статьи в последнем издании его учебника физиологической химии.

Наши обе реакции - растворение белка и свертывание молока - во всяком случае разные реакции, а если это так, то нет никакой необходимости в тождестве правил количественной зависимости времени реакции от концентрации ферментов. Скорость реакции определяется условиями реакции, которые то увеличивают, то уменьшают скорость. Соответственно характеру условий должны изменяться и правила зависимости скорости реакции от количества фермента в данном случае. С целью получить фактический материал, подтверждающий это, мы поставили несколько рядов опытов, где, меняя условия реакций, достигли соответствующего изменения правил. Нейтральный раствор молоко свертывающего фермента, раз он находится в жидкости в известной достаточной концентрации, свертывает молоко по правилу обратной пропорциональности между количествами фермента и временами свертывания. Хотя это давно известно, но мы позволяем себе, ради наглядного сравнения с последующим, привести таблицу (18), относящуюся к этому опыту.

Если мы берем кислый раствор того же фермента и прибавляем различное количество его к молоку, то теперь мы изменяем в молоке в совершенно той же пропорции количество как фермента, так и кислоты, т. е. если мы, например, увеличим вдвое количество фермента, то вместе с тем увеличиваем вдвое и количество кислоты в нем.

В таком случае первое правило обращается во второе: именно теперь количества фермента относятся обратно пропорционально, как квадратные корни их времен свертывания, т. е. реакция правильно ускоряется. Привожу таблицу (19).

Совершенно то же самое наблюдается и вом случае, если в растворе фермента имеются соли, ускоряющие свертывание. Если, например, натуральный желудочный сок нейтрализовался углекислым барием и такая нейтрализованная жидкость приливается в разных количествах к молоку, то она также свертывает молоко по второму правилу. Приводим таблицу (20).

Наконец, если взять значительно разведенный нейтральный раствор фермента и приливать его к молоку разными, но большими количествами, чтобы избежать предела, то часто наблюдается действие третьего правила: количества ферментов относятся теперь, как квадраты времен свертывания. Очевидно, разведение молока, идущее строго пропорционально вместе с увеличением фермента, правильно замедляет скорость реакции. Приводим таблицу (21).

Совершенно так же и правило растворения белка в зависимости от количества фермента может видоизменяться, смотря по условиям реакции. Обыкновенно в известных пределах концентрации фермента количество фермента связано с действием числом миллиметров переваренной белковой палочки (по Месту) за одно и то же время - правилом прямой пропорциональности между количеством фермента и квадратом числа миллиметров. Опять для наглядного сравнения приводим таблицу (22).